[发明专利]乙型肝炎核酸疫苗及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种新的抗HBV病毒的DNA疫苗及其构建方法。

背景技术

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性的传染病。我国是HBV感染高发区，约有7-8亿人感染过乙型肝炎，约1.2亿人为乙肝病毒携带者，他们中的1/4发展为慢性肝炎、肝硬化或原发性肝癌。自1985年我过开始接种乙肝疫苗以来，在免疫儿童中乙肝病毒携带者已由10％降至1％左右。因此实践证明，乙肝疫苗是预防和控制乙型肝炎最有效的武器。

乙型肝炎病毒为嗜肝DNA病毒，具有双层壳结构，外壳由乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、前S1蛋白(preS1)、前S2蛋白(preS2)构成；内壳由乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)构成；内壳内有双链环状DNA和DNA聚合酶。

目前有报道的乙肝病毒疫苗主要包含HBsAg、preS1、preS2和HBcAg任意一种或者几种基因，再加上一些具有免疫增强作用的细胞因子基因，或者淋巴细胞表位基因等(Qing Y，et al.Construction of an HBV DNA vaccine byfusion of the GM-CSF gene to the HBV-S gene and examination of its immuneeffects in normal and HBV-transgenic mice.Vaccine.2010Jun11；28(26)：4301-7.)。但是其免疫预防效果和治疗效果一直不尽人意，尤其是对慢性HBV感染者来说，由于体内长期存在相应抗原，机体免疫系统对于HBV抗原已经形成免疫耐受状态，因此其接种该疫苗后，免疫反应性远远低于正常人。因此乙肝DNA疫苗对于慢性乙肝患者的免疫耐受和激活HBV特异性T细胞免疫的效果不是很理想。

microRNA作为近年来生物学研究的热门分子受到广泛的关注。microRNA参与了生物体众多转录后调控过程，在细胞增殖分化、抗肿瘤与免疫等领域发挥重要作用。有研究表明，microRNA参与了人体许多免疫通路的调控，细胞免疫与体液免疫等领域都发挥重要作用。miRNA-181a能够调节B细胞分化，并能够调节CD4+T细胞活化与敏感性，因此可以作为天然的疫苗佐剂加以利用(Mark A.Lindsay.microRNAs and the immune response.Trends inImmunology，Volume 29，Issue 7，343-351)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够同时激活机体体液免疫与细胞免疫，免疫效果强，免疫作用持久，构建工艺简便的抗HBV病毒DNA疫苗。

如背景技术所述，现有的乙肝核酸疫苗存在诸多缺陷，因此如果能够在传统核酸疫苗后直接连接疫苗佐剂便可提高其免疫效果。基于以上理论，本发明人用分子生物学技术手段，将HBV病毒的表面抗原、核心抗原与e抗原基因克隆入真核表达载体，并在其后加入miRNA181a前体片段作为增强免疫效果的疫苗佐剂，从而构建一种既含有抗原蛋白基因又含有疫苗佐剂的新型乙肝DNA疫苗。

本发明提供了一种乙型肝炎核酸疫苗，以真核表达载体为基本骨架，含有乙肝病毒HBV包膜蛋白基因HBsAg、乙肝病毒核心抗原HBc与e抗原基因；还含有人的pre-miR181a序列，其中乙肝病毒HBV包膜蛋白基因HBsAg的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示、乙肝病毒核心抗原HBc与e抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；人的pre-miR181a序列如SEQ ID NO：5所示。

所述的真核表达载体为Invitrogen公司的真核表达质粒pcDNA^TM3.1/V5-His B。

本发明还提供了上述乙肝核酸疫苗的构建方法，包含以下步骤：

A、乙型肝炎病毒HBV包膜抗原、乙肝病毒核心抗原HBc与e抗原基因以及人miR181a前体基因克隆

(I)以HBV全基因组为模板，设计引物，通过PCR反应扩增得到HBV SDNA片段，引物序列如下：

S-F：ATGGAGAGCACAACATCAGG

S-F：TCAAATGTATACCCAAAGACAAAAGA

(II)以HBV全基因组为模板，设计引物，通过PCR反应扩增得到HBV C抗原与e抗原的DNA序列，引物序列如下：

C-F：ATGGACATTGACCCGTATAA

C-F：CTAACATTGAGATTCCCGAGAT