[发明专利]一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明设计一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)穿梭表达载体及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

在食品工业用酶的表达研究和工业发酵生产中，用微生物表达系统重组表达食品用酶，具有广泛的应用前景。目前大肠杆菌表达系统和酵母表达系统具有方便的来源，多年来很多研究机构开发了多种系列的表达载体和表达宿主菌，而且在多方向对大肠杆菌表达系统和酵母表达系统进行改造。但是大肠杆菌表达系统的许多问题依然存在，如包含体的形成，大肠杆菌表达宿主菌的毒性问题。酵母表达系统表达系统因为能解决部分真核来源异源蛋白表达的翻译后修饰问题，具有独特的优越性，但酵母表达系统低表达效率的问题是其主要的缺陷。

枯草芽孢杆菌表达系统的主要的优点是：1)与革兰氏阴性菌相比，无内毒素，是GRAS，具有安全性。2)它有很多分泌信号肽，枯草杆菌作为表达系统宿主菌可为重组蛋白的分泌提供充分的可选择的分泌信号肽，使得目的蛋白的胞外表达成功效率更高，同时可以降低胞内包涵体的形成概率，提高重组酶正确折叠的效率。3)芽孢杆菌是很多食品用酶的来源菌，该类酶在芽孢杆菌表达系统中的表达效果应该更好，许多同源蛋白重组胞外表达的成功效率可以达到25g/L以上。

但目前枯草芽孢杆菌表达系统尚存在许多问题：

(Ⅰ)虽然许多枯草芽孢杆菌表达载体，已经被构建、改造和使用，但目前可供选择的和可以高效率表达的载体和宿主细胞种类仍然是有限的，可改造性差，其可选择性远低于大肠杆菌表达载体和酵母表达载体。

(Ⅱ)启动子的序列优化，RBS序列的优化，RBS序列和ATG之间的距离待于进一步改进。

(Ⅲ)质粒稳定性差，相对于大肠杆菌表达系统，枯草芽孢杆菌细胞在复制中容易丢失质粒。

(Ⅳ)信号肽对于重组蛋白的有效分泌，起着非常重要的作用，需要发现更加有效的信号肽和发现新的启动子与信号肽组合，使得分泌功能更强，降低包涵体的形成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体。

本发明提供的表达载体，包括如下元件：人工设计的表达调控元件、枯草芽孢杆菌信号肽的编码序列、大肠杆菌的复制起始序列、抗生素抗性基因。

所述表达载体具有以下1)或2)所示的DNA序列；

1)DNA序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

2)与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性。

所述人工设计的表达调控元件由枯草芽孢杆菌P43启动子、枯草芽孢杆菌脱乙酰几丁质酶信号肽的编码序列CSN、F1噬菌体的终止子序列，人工设计的能被枯草芽孢识别的核糖体结合序列序列RSB、人工设计的枯草芽孢杆菌信号肽酶的酶切位点、人工设计的多克隆位点MCS组成。

所述表达调控元件DNA序列如以下3)或4)或5)所示；

3)其DNA序列为SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；

4)在严格条件下与3)限定的DNA序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列；

5)与3)或4)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且能促进目的基因转录和翻译的DNA序列。

所述抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。

所述表达载体的出发载体为pMA5。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供所述表达的载体的应用。

所述表达载体在构建转基因细胞系中的应用。

所述表达载体在构建基因工程菌株中的应用。

所述表达载体促进在目的基因转录和翻译中的应用。

本发明提供的载体既能在大肠杆菌中复制，又能在枯草芽孢杆菌中复制并表达，丰富了可用于枯草芽孢杆菌表达系统的载体；该载体首次使用B.subtilis脱乙酰几丁质酶信号肽，其引导分泌胞外蛋白的能力较强，报告基因为构巢曲霉果胶酸裂解酶基因，其胞外表达量达到600U/mL，远高于果胶酸裂解酶基因使用其它载体时的表达水平。

附图说明

图1表达调控元件模型(P43/CSN/F1T)

图2P43PCR电泳图

图3RBS-CSN-MCS-6His-TAATAA(B)合成电泳图

图4P43-RBS-CSN-MCS-6His-TAATAA合成电泳图

图5pBSCWZ表达载体物理图谱

具体实施方式

实施例1表达调控元件的设计