[发明专利]朝鲜淫羊藿的分子鉴定方法

说明书

一.技术领域：

本发明涉及中药材来源品种鉴定技术领域，采用特异性引物进行PCR扩增鉴定的分子方法。

二.背景技术：

中药淫羊藿为来源于小檗科淫羊藿属多个种植物的干燥地上部分，在我国有悠久的使用历史。其功效除了传统的补肾壮阳祛风湿之外，临床上还被用于治疗骨质疏松、更年期综合症、高血压、冠心病等疾病，另外淫羊藿还具有增强免疫力、抗衰老、抗肿瘤、抗艾滋病等作用，因此受到国内外的广泛关注。药典规定药材淫羊藿的来源物种包括：淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubscens Maxim.、朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai和巫山淫羊藿Epimediumwushanense T.S.Ying等5个种；《贵州省中药材、民族药材标准》中还收载了粗毛淫羊藿Epimedium acuminamm Franch.、天平山淫羊藿Epimedium myrianthum Stearn、黔岭淫羊藿Epimedium leptorrhizum Steam和毡毛淫羊藿Epimedium coactum H.R.Liang.，其来源之多在中药中是很罕见的。不同植物来源的淫羊藿药材其有效成分的含量存在很大的差异，再加上药材和饮片难以进行形态鉴别，这就对药材质量控制造成了很大的障碍，这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将不同来源的淫羊藿药材和饮片加以鉴定区分。通过比较不同药用淫羊藿品种的一段DNA碱基序列，找到了朝鲜淫羊藿和其他药用淫羊藿品种存在差异的一段序列，这种差异可以通过进行鉴定性PCR来区别。

三、发明内容

本发明的目的是提供一种在药用淫羊藿品种中准确鉴定朝鲜淫羊藿的鉴定性PCR分子鉴定方法，该方法包括朝鲜淫羊藿的特征性DNA碱基序列、两对鉴定性PCR引物及其鉴定方法。

本发明的技术方案如下：首先从各药材中提取基因组DNA，然后利用该方法进行鉴定。

本发明设计的朝鲜淫羊藿聚合酶链式反应的鉴定引物DNA序列为：

引物1：kor.-aF：5’-CAGCGAACTTGTGAAAAACAC-3’

引物2：kor.-bR：5’-CGATAAGAGAACAAAGGGCTA-3’

引物3：kor.-bF：5’-CGAACTTGTGAAAAACAC-3’

用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即得到鉴定引物的白色粉末结晶。

中药材朝鲜淫羊藿聚合酶链式反应鉴定的方法为：

1、药材DNA的提取：按照常规植物DNA的提取方法或者用市售植物基因组提取试剂盒进行，用无菌去离子水溶解供试品DNA模版，并将模版浓度调整到能够进行常规PCR反应的浓度；

2、模版DNA质量的鉴定：用另一对引物鉴别模版DNA的质量，该对引物能够扩增淫羊藿属植物的线粒体基因组nad1第2内含子序列。引物的DNA序列为nad1-2intron-up：5’-GGT CTT ATT CTT ATT GTG CGC CT-3’，nad1-2intron-low：5’-TTC GTC TAT ACCAGA CCA TAA GG-3’。反应体系为：引物各01uM，10ul的2×PCR StarMix，模版DNA约20ng，用无菌去离子水补充反应体积到20ul。PCR扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min。取5ul的PCR产物在1％琼脂糖凝胶(包括适量的溴化乙锭，即EB)检测扩增结果。如果得到1800bp左右的条带，则表明DNA模版合格，可以进行后续的鉴定试验，如果没有阳性条带，则需要改进DNA提取方法，以得到合格的模版DNA。对于模版DNA质量的鉴定，也可以选择其他能够在淫羊藿属植物中成功扩增的引物对进行；

3、鉴定性PCR反应：引物用无菌去离子溶解并稀释至2umol/uL。以25uL反应体系为参照，各物品的用量为：

10×PCR反应缓冲液   2.5ul

dNTPs(2.5mM)        1.6ul

primer 1(2um)       2ul

primer 2(2um)       2ul

Easy Taq(5U/ul)     0.3ul

DNA模版             20ng

ddH2O               补充体积到25uL