[发明专利]朝鲜淫羊藿的分子鉴定方法

权利要求书

1.一种来源为朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum的中药淫羊藿药材聚合酶链式反应鉴定引物，其特征在于：

可分别用两对鉴定引物kor.-aF&kor.-bR以及kor-bF&kor.-bR对朝鲜淫羊藿进行分子鉴定。鉴定引物DNA序列为kor.-aF：

5’-CAGCGAACTTGTGAAAAACAC-3’，kor.-bR：5’-

CGATAAGAGAACAAAGGGCTA-3’以及kor.-bF：5’-

CGAACTTGTGAAAAACAC-3’，用全自动DNA合成仪按上述鉴定引物的DNA序列进行合成，即得到鉴定引物的白色粉末结晶。

2.根据权利要求1所述鉴定引物鉴定朝鲜淫羊藿原植物以及来源于朝鲜淫羊藿的中药淫羊藿药材和饮片的方法，其特征在于朝鲜淫羊藿聚合酶链式反应(PCR)鉴定的步骤为：

(1)药材DNA的提取：按照常规植物DNA的提取方法或者用市售植物基因组提取试剂盒进行，用无菌去离子水溶解共试品DNA模版，并将模版浓度调整到能够进行常规PCR反应的浓度；

(2)模版DNA质量的鉴定：用另一对引物鉴别模版DNA的质量，该对引物能够扩增淫羊藿属植物的线粒体基因组nad1第2内含子序列。引物的DNA序列为nad1-2intron-up：5’-GGT CTT ATT CTT ATT GTG CGC CT-3’，nad1-2intron-low：5’-TTC GTC TAT ACC AGA CCA TAA GG-3’。反应体系为：引物各0.1uM，10ul的2×PCR StarMix，模版DNA约20ng，用无菌去离子水补充反应体积到20ul。PCR扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min。取5ul的PCR产物在1％琼脂糖凝胶(包括适量的溴化乙锭，即EB)检测扩增结果。如果得到1800bp左右的条带，则表明DNA模版合格，可以进行后续的鉴定试验，如果没有阳性条带，则需要改进DNA提取方法，以得到合格的模版DNA，对于模版DNA质量的鉴定，也可以选择其他能够在淫羊藿属植物中成功扩增的引物对进行；

(3)鉴定性PCR反应：引物用无菌去离子溶解并稀释至2umol/uL。以25uL反应体系为参照，各物品的用量为：

10×PCR反应缓冲液    2.5ul

dNTPs(2.5mM)     1.6ul

primer 1(2um)    2ul

primer 2(2um)    2ul

Easy Taq(5U/ul)  0.3ul

DNA模版          20ng

ddH2O            补充体积到25uL

(4)PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应

(5)电泳检测：取5uLPCR反应液与1uL加样缓冲液混合，1％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测PCR扩增产物；

反应体系可以因为酶的活性、模版DNA的质量等原因进行调整；

检测结果有阳性条带，则检测对象为朝鲜淫羊藿；如果是阴性结果，则检测对象不是朝鲜淫羊藿。