[发明专利]一种含有免疫球蛋白基因的载体、构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种载体，具体地涉及一种含有免疫球蛋白基因的载体及其构建方法，并以葡激酶(staphylokinase SAK)的融合表达为例，说明该载体在延长重组蛋白药物在体内半衰期方面的应用。

背景技术

利用DNA体外重组技术获得目的蛋白是蛋白质结构功能和生物工程医药研究的基础。基因组学和蛋白组学研究的不断深入，极大地拓展了新型蛋白质药物的研究领域。经过几十年的探索，外源基因在原核细胞中的高效表达技术已经比较成熟，已有大量通过该表达的重组蛋白应用于临床。然而目前临床上使用的第一代基因工程蛋白药物，大多数存在半衰期短、需要频繁给药才能达到治疗效果，增加了患者治疗成本，严重降低了患者的生活质量等问题，从某些方面来说限制了重组蛋白药物的临床应用。因此延长重组蛋白在体内的半衰期，降低外源蛋白的免疫原性是重组蛋白药物研究需要迫切解决的问题。

IgG(Immunoglobulin gamma)型的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可长达21天，与基因工程蛋白药物相比，Fc融合蛋白具有半衰期长、亲和力高和免疫源性低等优势。将人IgG的Fc区域与其它蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合形成融合蛋白以延长半衰期已有报道(Capon DJ，Chamow SM，Mordenti J，et al.Nature，1989，337，525～531；Chamow SM，Ashkenazi A，TrendsBiotechnol，1996，14(2)：52～60)，由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出的体外药物代谢动力学特性与同类型的人IgG相当。这种制备融合蛋白的方法已用于一些重要的细胞因子如IL-2和IFNa-2a和可溶性受体如TNF-Rc和L-5-Rc(Landolfi NF.US PatentNo.5349053；SmithCA，Goodwin RG，Beckmann MP.US PatentNo.6224867)，由此制备的一些药物已成功地使用在临床上并用于治疗一些特定疾病。据此，我们希望采用基因工程技术制备一种能融合表达IgG Fc片段的载体，以期提供高效的应用平台，使外源基因能方便地与IgG Fc片段融合，融合IgG Fc片段的重组蛋白不仅具有多肽或蛋白所特有的生物学功能，而且兼备较长血清半衰期等特性(HodgesTL，Antimicro-Agonts-Chemother，1991，35：2580-2586)。

到目前为止，尚未见到利用人IgG1Fc段构建融合表达载体的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有免疫球蛋白基因的载体。

本发明的目的也在于提供该载体的构建方法。

本发明的目的还在于提供一种包含该载体的转化体。

本发明的目的还在于提供该载体在延长重组蛋白药物在体内半衰期方面的应用。

本发明的一种含有免疫球蛋白基因的载体，包含编码免疫球蛋白IgG1Fc片段的基因，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该载体被命名为pBV220/Fc。

所述编码免疫球蛋白IgG1Fc片段的基因来源于人，其核苷酸序列为SEQ IDNo.1中的7-717bp。

本发明的转化体为含有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的载体。

所述pBV220/Fc融合表达载体具备XholI、BamHI、SalI、HincII、PstI、HindIII多克隆酶切位点。

所述载体的构建方法，按如下操作步骤进行：

(1)根据来源于人的IgG1基因序列，设计并合成针对上述基因序列的引物，以来源于人的基因组或基因组文库为模板，通过PCR方法扩增目的产物；

(2)用T₄连接酶将回收后的目的产物，与pEASY-T载体连接，经转化和筛选阳性克隆后，进行酶切和测序鉴定；

(3)测序正确的连接产物和pBV220载体分别经EcoRI和BamHI双酶切后用T₄连接酶连接，经转化和筛选阳性克隆后，进行酶切和测序鉴定，最终获得重组载体，命名为pBV220/Fc。

所述的引物如下：

上游引物：

5′-GGAATTCCATGGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTC-3′(SEQ ID No.2)

下游引物：

5′-TAAATGAGTGCGACGGGGCGGTGGCGGATCGCTCGAGGCGGGATCCCGCCCG-3′(SEQ ID No.3)