[发明专利]一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种黄瓜枯萎病菌检测方法。

背景技术

黄瓜枯萎病是由黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum，也称为尖孢镰刀菌)寄生引起的一种世界性土传真菌病害，侵染广泛，病原菌从根部侵入，引起维管束病害，造成植株枯死，在植株的全生育期均可发生，尤其在成株期发病严重。

黄瓜枯萎病尤为严重，一旦发病，难以根除，并随着连作年份的增加，发病率升高，是一种顽固的土传病害，病田一般减产20％～30％，严重田块可达50％～60％，甚至绝产，是目前造成黄瓜生产大面积减产的主要原因。因此，及早对枯萎病菌侵染初期作出检测和诊断，建立快速、准确的枯萎病早期预警诊断方法具有重要的理论和应用价值，对及时有效控制病原菌的传播和病害流行以及及时有效防治其危害具有重要意义。

目前，黄瓜枯萎病菌分子检测方法的研究，陈微等人采用PCR-RFLP和巢式PCR方法，能够从人工接种感病黄瓜苗上检测到病原菌的存在，PCR-RFLP方法所用引物为真菌通用引物，特异性不强，而且需将PCR产物进行限制性酶切分析，方法繁琐，特异性不强；巢式PCR方法需要2步PCR扩增，增加了污染机会，而且没有对两种方法的灵敏性进行分析。

发明内容

本发明目的是为了解决现有黄瓜枯萎病菌分子检测中采用PCR-RFLP方法存在真菌通用引物特异性不强及方法繁琐，而采用巢式PCR方法需要2步PCR扩增，易污染的问题，而提供一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法。

黄瓜枯萎病菌分子检测方法按以下步骤实现：一、根据黄瓜枯萎病菌的核糖体内转录间隔区(ITS)DNA序列的特性，设计对枯萎病菌具特异扩增作用的一对引物Fc-1和Fc-2；二、提取染病样品基因组DNA，采用引物Fc-1和Fc-2对基因组DNA进行PCR扩增；三、将PCR扩增产物在含GelRed染色剂的1.0％琼脂糖凝胶上用1×TAE缓冲液进行电泳，电泳结束后用凝胶成像系统分析，在315bp处出现特异条带，则染病样品带有黄瓜枯萎病菌，即完成检测；其中步骤一中Fc-1为5`-CATACCACTTGTTGCCTC-3`，Fc-2为5`-ATTAACGCGAGTCCCACC-3`；步骤二中PCR扩增反应体系：25μl反应体系，由10×PCR缓冲液2.5μl(200mM Tris-HCl pH 8.4，200mM KCl，100mM(NH₄)₂8O₄，20mM MgSO₄)，2.5mM dNTP 2μl，10μM引物Fc-11μl、10μM引物Fc-21μl，10ng/μl基因组DNA 1μl，Easy Tag DNAPolymerase 1U和余量无菌去离子水组成；步骤二中PCR扩增条件为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环，最后72℃延伸10min补齐末端，扩增完成；步骤三中电泳的电压为4～5V/cm。

本发明黄瓜枯萎病菌分子检测方法中，选取具有特异性的黄瓜枯萎病菌的核糖体内转录间隔区DNA序列，设计的引物Fc-1和Fc-2具有高度特异性，表现为该引物仅对黄瓜枯萎病菌具特异扩增产物，对其他33种病原真菌和细菌均无扩增产物。本发明中PCR方法的灵敏性高，表现为该PCR方法对枯萎病菌基因组DNA的最低检出量为10fg，对土壤中病菌孢子的检出量为1000个孢子/克土壤。本发明中PCR方法的快速性表现为仅需1步反应在2h内就可获得检测结果，快速、简单，不易污染。本发明中PCR可以从无症状早期感病植株中检测到病原菌，重复性和稳定性高，可以作为黄瓜枯萎病早期预警诊断方法进行实际应用。

附图说明