[发明专利]一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法

权利要求书

1.一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法，其特征在于黄瓜枯萎病菌分子检测方法按以下步骤实现：一、根据黄瓜枯萎病菌的核糖体内转录间隔区DNA序列的特性，设计对枯萎病菌具特异扩增作用的一对引物Fc-1和Fc-2；二、提取染病样品基因组DNA，采用引物Fc-1和Fc-2对基因组DNA进行PCR扩增；三、将PCR扩增产物在含GelRed染色剂的1.0％琼脂糖凝胶上用1×TAE缓冲液进行电泳，电泳结束后用凝胶成像系统分析，在315bp处出现特异条带，则染病样品带有黄瓜枯萎病菌，即完成检测；其中步骤一中Fc-1为5`-CATACCACTTGTTGCCTC-3`，Fc-2为5`-ATTAACGCGAGTCCCACC-3`；步骤二中PCR扩增反应体系：25μl反应体系，由10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，10μM引物Fc-11μl、10μM引物Fc-21μl，10ng/μl基因组DNA1μl，Easy Tag DNA Polymerase 1U和余量无菌去离子水组成；步骤二中PCR扩增条件为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环，最后72℃延伸10min补齐末端，扩增完成；步骤三中电泳的电压为4～5V/cm。

2.根据权利要求1所述的一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法，其特征在于步骤一中黄瓜枯萎病菌的核糖体内转录间隔区DNA序列为：

cataccactt gttgcctcgg cggatcagcc cgctcccggt aaaacgggac ggcccgccag

aggaccccta aactctgttt ctatatgtaa cttctgagta aaaccataaa taaatcaaaa

ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcaaa atgcgataag

taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgcca

gtattctggc gggcatgcct gttcgagcgt catttcaacc ctcaagcaca gcttggtgtt

gggactcgcg ttaat。

3.根据权利要求1或2所述的一种黄瓜枯萎病菌分子检测方法，其特征在于步骤二中提取染病样品基因组DNA是将20mg染病样品置于-70℃冷冻3h，取出后放入灭菌研钵中进行研磨，加入500μl的TES缓冲液，然后将溶液转入离心管中放入60℃水浴中温育1h，取出后加入140μl的5M NaCl和65μl的10％CTAB之后放入65℃水浴中温育10min，再加入700μl氯仿在0℃放置30min，取出后4℃下离心10min，将上层溶液移到新的灭菌的离心管中，加入RNA酶5μl，37℃温育1h后加入510μl异丙醇置于冰上30min沉淀DNA，然后在4℃、12000r/min的条件下离心10min，收集沉淀，用质量浓度为70％冰乙醇洗涤1次，吹干后溶于无菌去离子水中，稀释DNA终浓度为10ng/μl。