[发明专利]一种鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法

说明书

技术领域

本发明属于辣椒育种领域，具体涉及一种植物分子标记技术，特别涉及 一种鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法，该方法适用于抗疫病分子标记辅 助育种。

背景技术

辣椒疫病是危害辣椒生产的主要病害之一，在世界上许多国家都有发 生，在我国青海、新疆、甘肃、陕西、北京、辽宁、上海、浙江、湖南、四 川、云南等辣椒主产区均有大面积发生、流行的报导。随着辣椒产业的发展， 辣椒疫病有逐年加重的趋势，造成了严重的经济损失。该病害的病原菌为 (Phytophthora capsici Leon)，辣椒的苗期、成株期均可受害，茎、叶和果 实都能发病。传播速度快，发病田经常绝产，造成严重的经济损失。目前生 产上控制辣椒疫病以化学防治为主，防治效果差，且污染环境；此外，辣椒 疫霉菌易发生变异，常导致耐(抗)药菌株的产生。采用土壤消毒虽有较好 地防效，但生产上大面积使用则较为困难。

抗疫病品种的应用是防治或减轻辣椒疫病危害的有效途径。目前世界上 许多辣椒主产国家均已把选育抗疫病品种作为辣椒育种工作的主要目标之 一。但目前对疫病表现出极高抗性的辣椒资源，它们的共同缺点是果形小、 品质较差、转育周期长，难以满足辣椒产业化对品种更新换代加速的要求。 与传统育种相比，分子标记育种更快、更节省人力、节约时间、提高效率。 分子标记技术在植物育种中主要起辅助性作用。它主要寻找与目标基因紧密 连锁的分子标记，然后从杂交子代中检测分子标记是否存在。检测到了分子 标记的植株，表明含有目的基因，可以进一步优化和筛选。

利用抗病基因产物具有保守结构域的特性，通过人工合成与已知抗病基 因产物的保守序列类似的简并引物，以植物总DNA为模板进行PCR扩增，就 可得到该种植物的抗病基因同源序列。许多研究证明，一些抗病基因同源序 列与抗病基因密切连锁，甚至就是抗病基因的一部分。此外，抗病基因同源 序列还具有容易获得、扩增结果稳定和使用费用低廉等优点。因此，分离和 克隆植物的抗病基因同源序列成为当前人们比较认同的标记、定位和克隆植 物抗病基因的策略之一。

利用抗病基因同源序列获得的基因，往往是一段缺乏5’端与3’端的DNA 序列，获得全长基因序列可采用未知侧翼序列扩增——DNA Walking步移 法，简称步移法。此法所选择的引物虽与已知DNA序列互补，但两引物3’ 端是反向的。染色体步移技术主要应用于基因克隆、步查获得新物种中基因 的非保守区域、鉴定T-DNA或转座子的插入位点、染色体测序工作中的空隙 填补，从而获得完整的基因组序列等方面。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种鉴别 辣椒抗疫病性状的分子标记方法，该方法采用与辣椒抗疫病基因紧密连锁的 抗病基因同源序列分子标记，从而实现在育种过程中快速、有效选择抗疫病 材料，加速辣椒抗疫病育种进程。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术解决方案：

一种鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)人工设计合成一对核苷酸序列作为引物，该引物是由碱基组成的特 定序列的寡聚体，其中：

正向引物：5’-AGGTGGTCTTCAATGATCAGAGA-3’

反向引物：5’-CCTGAGGCAAATTCCAAATCTC-3’

2)提取辣椒基因组的DNA，以引物对辣椒基因组DNA进行PCR扩增， 抗疫病材料和感疫病材料均可扩增出长度为590bp的片段；

3)PCR扩增产物在37℃条件下经Bcg I酶切16h后，Bcg I酶的酶切 位点为：抗疫病品种克隆的基因序列第324bp处；酶切产物经2％琼脂糖凝 胶上电泳、溴化乙锭染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录，抗疫病植株酶 切产物有325bp和265bp两条谱带，感疫病植株只有590bp一条谱带。

本发明的鉴别辣椒抗疫病性状的分子标记方法，步骤简单快捷、稳定可 靠，鉴别结果与田间抗病性鉴定结果准确一致、重复性好，特别适用于抗疫 病分子标记辅助育种，能够很好地提高选择效率，加速育种进程。

附图说明

图1为7个辣椒自交系PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析。M：DNA Marker；1：A5；2：A11；3：B17；4：B23；5：B2；6：B32；7：B19