[发明专利]固体支持物上的靶分子的检测和/或定量

说明书

发明背景

1.发明领域

本发明涉及用于检测和/或定量溶液中存在的一种或多种靶分子的方法、仪器和试剂盒，通过在线定量其对固定在固体支持物表面上的特定捕获分子的结合，而无需对溶液中存在的靶分子的实质性检测。更特别地，本发明包括实时检测微阵列上存在的捕获DNA分子和溶液中存在的靶多核苷酸之间的杂交。最后，本发明还涉及多重靶的实时PCR。

2.相关技术描述

获得关于最小量样品的最大量信息是分析科学的主要目标。这特别适用于分子生物学和其中需要高度平行分析的所有基于分子的生命科学中。微阵列技术是这种需求的一个答案。它使得能够在相同溶液中同时执行结合事件的大量平行测定和多重测量。微阵列通常由许多微型斑点组成，每个微型斑点包含等同分子，即作为捕获分子的核酸或蛋白质。斑点的数目可以从小于一百到数千不同。通过附着优选经共价键将分子固定至固体支持物。微阵列实验的主要任务是同时检测许多结合事件。

因为荧光的灵敏度高，其在大多数应用中用作标记以检测结合事件。在实施实验前，样品必须借助于合适的荧光物进行标记。在分开的温育步骤中实现结合，并且在微阵列的适当洗涤和干燥后获得最终结果。微阵列阅读器通常在结合过程的给定时间获得关于荧光强度的信息，所述结合过程理想地将是到达热力学平衡的时间。然而，在芯片实验中采用的常规条件下，难以获得热力学平衡，并且由于例如动力学中的差异、扩散常数和捕获分子浓度的几种限制，无法同时到达不同浓度的、生物样品中存在的不同靶，所述不同浓度可能相差几个对数尺度。因此，在固定实验背景中，难以设定其中与其捕获分子结合的靶量将与溶液浓度直接成比例的实验条件。

在几个洗涤步骤后进行在微阵列上的结合步骤后的定量步骤，这暗示关于过程的某些基本信息例如结合反应的动力学完全丧失。

克服依赖于单个样品中存在的不同靶的结合效率或浓度中的易变性问题的一个解决方案是获得关于溶液中存在的每个个别靶实时结合反应的数据。

Bier和Schmidt(2004，Anal.Bioanal.Chem.，378，52-53)教导了使与整合检测方案组合的流体处理方法集合的必要性，以在微阵列上进行可能的实时分析。该方法基于跟踪对携带标记的双链DNA的斑点的实时酶反应。固定的DNA充当关于酶的结合受体，并充当待通过限制性酶切割的底物。在添加辅因子Mg2+后，其中DNA通过酶切割的斑点通过在给定位置处荧光强度的减少进行鉴定(负测定法)。

Bier和Kleinjung(2001，Fresenius J.Anal.Chem.，371，151-156)提出通过获得关于微阵列的每个斑点的熔解曲线来测量主要在解离相中的杂交动力学。根据相同想法，US-P-6,589,740公开了检测在芯片上的荧光靶的杂交反应的方法。在预定时机获取反应的图像，同时将洗涤溶液注入容器内并且同时根据预定时间模式改变生物芯片的温度。通过在增加的温度下洗涤芯片获得熔解曲线。随着温度升高，具有较弱结合能力的样品DNA开始与探针DNA解离，并且用洗涤溶液从斑点中去除解离的样品DNA。因此，杂交的荧光标记样品DNA的量随着时间流逝而减少，并且荧光强度也是如此。

WO 06/053769提出用于实时检测处于溶液中的靶而作用于其相应固定捕的获分子的方法。该方法依赖于光源的使用，所述光源用于激发结合靶，且测定发射的光。该方法使用共聚焦扫描方法，这允许获得来自激发光聚焦处的结合靶的比来自溶液中存在的靶更佳的信号。尽管结果是阳性且令人信服的，但该方法的局限性是测定法的高本底。

US-P-6,416,951教导了用于实时测量RNA与多核苷酸探针杂交的动力学的另一种方法。动力学如下进行测量：通过在嵌入染料的存在下杂交，并且记录随着杂交进行染料的分光性质中的改变，或者在RNA或探针中掺入标记，使未标记分子与固体支持物附着，在附着分子附近产生消散波，并且记录随着杂交进行通过消散波与标记的相互作用产生的信号中的增加。

WO 99/57310A2使用包括点形式的矩阵的支持物，其中矩阵的每个点代表分子的个别种类。矩阵由凝胶样支持物制成。每个点对应于检测用的光学透镜。允许样品流过微流体结构，并且用杂交的实时测量进行靶的结合。流体流动帮助检测，因为溶液通过流过矩阵而不保持与捕获分子接触，并且在洗涤后执行所提出的检测。