[发明专利]辣椒疫病菌分子检测引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域，更具体涉及一种辣椒疫病菌分子检测引物及其应用。

背景技术

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)侵染引起的一种毁灭性病害，该病于1918年首次在美国新墨西哥州发现，现已成为世界各国辣椒生产上的主要病害(Ristaine etal.，1999)。辣椒疫霉菌寄主范围广，除辣椒外，还可侵染茄科和葫芦科的番茄、茄子、西瓜和西葫芦等50多种作物(Tian et al.，2004；Hausbeck，et al.，2004)，其发生面积广，危害十分严重，在适宜发病条件下，病害大流行可造成寄主作物绝收(Gevens et al.，2007；姜彦全等，2008；刘学敏等，2007)。同时，辣椒疫霉菌是一种土传病原菌，它可以经雨水、土壤、病残体等从发病区向未发病区传播，而且其侵染能力强，由其引起的病害多属于多循环病害，在较短的时间内可造成植株死亡、根茎和果实腐烂。因此，开展辣椒疫霉菌检测，防止其从发病区向未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，对辣椒疫病的及时控制具有重要意义(Silvar，et al，2005)。

自从发现辣椒疫霉菌以来，各国研究人员便对其检测技术进行研究，传统的检测方法是采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定，来确定是否存在辣椒疫霉菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定是否由辣椒疫霉菌引起的病害。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经验，最重要一点是它不能满足病害防治中制定最佳防治时期的需求，因此传统病原学检测方法已不能满足现代植物病理学研究的需要，因其很容易错过病害防治的最佳时期(Kelly，et al.，2006；Schena，et al.，2008)。

随着分子生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的成功例子已越来越多(Li et al，2003)。国内外有学者利用基于ITS碱基序列设计引物对辣椒疫霉菌的分子检测开展研究(Silvar et al.，2005；Zhang，et al.，2006)，但是ITS在病原菌的近缘种之间变化很小，从ITS序列上设计引物很难将两个相以性高的种区分开(Martin and Tooley，2003)，很难从ITS序列上对它们进行区分(Brasier et al，2004)。因此要对辣椒疫霉菌进行高灵敏性和特异检测，应从疫霉菌其它基因上设计引物进行检测。已有研究表明，疫霉菌属中的YPT1基因(ras-related protein)含有多个外显子和内含子，多个外显子具有保守性，而这些内含子在不同种之间具有多变性，非常适合于设计引物进行疫霉属卵菌近缘种的分子检测，区分不同种的疫霉菌(Schena et al，2006)。

发明内容

本发明的目的是提供一种辣椒疫病菌分子检测引物及其应用，针对现有技术中辣椒疫病菌的生物学检测方法所需周期长、目前辣椒疫病菌分子检测测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种辣椒疫病菌的特异分子检测引物，方法结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高，可用于带菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间辣椒疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，此技术对于辣椒疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。

实现本发明的目的包括下列步骤：

1.根据辣椒疫病YPT基因序列的特异性，设计了对辣椒疫病菌具有特异扩增作用的一对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物PCA1F：5‘-GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA-3’

下游引物PCA2R：5‘-ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT-3’，

2.辣椒疫病菌特异分子检测体系的建立

(1)被辣椒疫病菌、辣椒疫病菌感染的植物组织或存在辣椒疫病菌的土壤中提取DNA

(2)PCR扩增：PCR反应体系25μl，包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，50μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5μmol/L和10ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl，PCR反应条件为：95℃预变性2min；94℃2变性1min，60℃退火30sec，72℃延伸1min共35个循环；72℃延伸10min。