[发明专利]辣椒疫病菌分子检测引物及其应用

权利要求书

1.一种辣椒疫病菌分子检测引物，其特征在于：所述辣椒疫病菌分子检测引物的序列为：

PCA1F：5‘-GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA-3’

PCA2R：5‘-ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT-3’。

2.根据权利要求1所述的辣椒疫病菌分子检测引物，其特征在于：所述辣椒疫病菌分子检测引物PCA1F和PCA2R对辣椒疫病菌特异性扩增出364bp的产物。

3.根据权利要求2所述的辣椒疫病菌分子检测引物，其特征在于：所述辣椒疫病菌分子检测引物特异引物序列获得方法为：以辣椒疫病菌和多个疫霉属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下：取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900μl重量浓度2％十六烷基三甲基溴化铵CTAB提取液和90μl重量浓度10％十二烷基苯磺酸钠SDS后混匀，于55～60℃水浴1.5h，每10min振荡混匀一次，水浴1.5h后离心15min，离心速度为12,000rpm，取上清液加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为：25∶24∶1，离心5min，离心速度为12,000rpm，取上清液，即水相，加入等体积氯仿抽提一次，离心5min，离心速度为12,000rpm，吸上清液，加0.1体积的3mol/L NaAC溶液和2体积的-20℃无水乙醇，-20℃下沉淀30min后12,000rpm离心5min，轻轻地倒去上清液，加入700μl体积浓度70％的-20℃乙醇进行洗涤，稍离心，倾掉上清，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μl待用；在辣椒疫病菌特异DNA片段序列的基础上应用ClustalX软件比对设计特异引物，获得辣椒疫病菌分子检测引物特异引物序列，经对供试菌株和42株辣椒疫病菌的特异性进行PCR验证，所述特异引物在辣椒疫病菌上特异性地扩增出364bp的产物。

4.根据权利要求3所述的辣椒疫病菌分子检测引物，其特征在于：所述CTAB提取液为重量浓度2％CTAB；100m mol/L Tris-HCl，PH 8.0；20mmol/L EDTA，pH8.0；1.4mol/L NaCl。

5.根据权利要求3所述的辣椒疫病菌分子检测引物，其特征在于：所述1×TE溶液为10mmol/LTris-HCL，0.1mmol/LEDTA，pH8.0。

6.根据权利要求3所述的辣椒疫病菌分子检测引物，其特征在于：所述对供试菌株和42株辣椒疫病菌的特异性进行PCR验证的具体的反应体系是：PCR反应体系25μl，包括2.5μl  10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg²⁺，50μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5μmol/L和10ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl，PCR反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性1min，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。

7.一种如权利要求1、2、3、4、5或6所述的辣椒疫病菌分子检测引物的应用，其特征在于：所述的辣椒疫病菌分子检测引物应用于辣椒疫病菌的快速分子检测诊断，按照以下步骤检测：

(1)从被辣椒疫病菌感染的植物组织或存在辣椒疫病菌的土壤中提取DNA；

(2)以该DNA为模板用所述的一对引物PCA1F和PCA2R通过聚合酶链式反应PCR扩增；PCR反应体系25μl，所述PCR反应体系为2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2.0mmol/LMg²⁺，50μmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5μmol/L和10ng模板DNA，d.d.H₂O补足25μl；PCR反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性1min，60℃退火30sec，72℃延伸1min共35个循环；72℃延伸10min；

(3)然后取适量步骤(2)的PCR扩增产物用琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出364bp的产物，即可判断所述的植物组织或土壤样品中存在辣椒疫病菌。