[发明专利]杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺

说明书

技术领域

本发明属于微生物酶制剂领域，特别涉及一种杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺。

背景技术

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(p-diphenol oxidase，EC 1.10.3.2)，是木质素降解酶系的主要成分之一。自然界中诸如杂色云芝Coriolus versicolor等白腐菌均能分泌漆酶。白腐菌是目前最重要的漆酶产生菌，但白腐菌生长周期长、酶活低，不利于工业化生产。目前，国内主要围绕如何提高白腐菌漆酶的产量而开展研究，采用菌种筛选和改造，培养方式及培养条件优化来达到利用微生物生产漆酶的目的。

近年来，有关漆酶的研究越来越受到国际上的重视，由于漆酶能降解木质素，而且能降解多种有毒化合物，所以漆酶在食品工业、造纸工业、保护环境及其他领域具有很大的研究价值和应用潜力。因此研究漆酶的异源表达具有重要的现实意义。随着分子生物学技术的发展，一些漆酶基因已经从木质素降解菌中克隆并进行了性质分析，为实现漆酶基因的异源表达奠定了坚实的理论基础。1990年Kojima首次将Corilous hirsutus的漆酶基因进行了克隆并在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中表达(Kojima Y，Tsukuda Y，Kawai Y.etal.Cloning，sequence analysis，and expression of ligninolytic phenoloxidase genes of thewhite-rot basidiomycete Coriolus hirsutus[J].Journal of Biological Chemistry，1990，265：15224-15230(白腐菌Coriolus hirsutus漆酶基因的克隆，序列分析和表达，生物化学杂志))。2003年Liu等利用Pichia pastoris表达了Fome lignosus的漆酶(Liu W，Chao Y，Liu S.et al.Molecular cloning and characterization of a laccase gene from the basidiomycete Fome lignosusand expression in Pichia pastoris.Applied Microbiology and Biotechnology.2003，63：174-181(白腐菌Fome lignosus漆酶基因的特性和分子克隆及在巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris中表达，应用微生物和生物技术))。

白腐菌漆酶为胞外蛋白，它是由一系列同工酶组成的，典型的分子量在60-80kDa。杂色云芝是一种典型的木材白腐菌，对木质素的降解能力较强。杂色云芝在液体培养基中产生的漆酶同工酶主要是Lcc1。利用甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)对杂色云芝漆酶Lcc1进行了异源表达构建基因工程菌已有报道(郭梅，白东清，蒲军，杜连祥，路福平.去自身信号肽漆酶基因的克隆及转化甲醇毕赤酵母，2005年全国工业微生物年会论文，2005.4：66-70。)(郭梅，蒲军，杜连祥，路福平，白东清.杂色云芝漆酶基因(Lcc1)的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达，菌物学报，2005，24(2)：221-226)。

甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)PMAD16，是一种新型外源基因表达系统，异源蛋白的表达仅需少量甲醇作为诱导剂。甲醇毕赤酵母PMAD16高密度发酵时培养基的组成以及发酵条件直接影响菌体的生长和外源基因的表达。PMAD16可以甲醇为唯一碳源生长，因此利用甲醇毕赤酵母表达外源蛋白时，往往需要生长培养基与诱导表达培养基分开，通常采用传统转换培养基诱导法，先用葡萄糖为碳源的BMDY培养基增殖酵母，再离心收集菌体，然后重悬在含甲醇的BMMY培养基中诱导外源基因的表达，这种表达方法本研究也有报道，(郭梅，路福平，蒲军，白东清，杜连祥.杂色云芝漆酶基因在甲醇毕赤酵母中表达条件研究，食品研究与开发，2006，27(4)：82-84)，但这种方式操作繁琐，浪费培养基，同时增加了染菌机会，尤其在用发酵罐大量培养酵母生产外源蛋白时极为不利，不适宜工业化生产。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，本发明的技术方案概述如下：

杂色云芝漆酶在甲醇毕赤酵母中异源表达发酵工艺，包括如下步骤：

(1)准备菌株和培养基