[发明专利]检测HPV的方法及Phi29DNA聚合酶在检测HPV中的应用

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤指一种检测HPV的方法以及其它Phi29DNA聚合酶在检测病毒中的应用。

背景技术

宫颈癌在全球妇女的癌症死因中高居第二位，世界上每年的新发病例约为45万，死亡率为50％。Drs.Rous and Beard最早在1934曾经提出HPV为致癌物质，此后自1974年Zur Hausen提出HPV是宫颈癌的最可能因素后，国内外学者就HPV感染与子宫颈癌的关系进行了大量的研究，并获取了许多实验室与临床证据。1977年Laverty在电镜中观察到子宫颈癌活检组织中存在HPV颗粒，1981年第一次在生殖道分离出了HPV，1983-1986年依次从宫颈癌样本中分离出HPV16、18、31、35等型别。1995年IARC专题讨论会确定：HPV感染是子宫颈癌的主要病因。目前研究发现99.7％的宫颈鳞状细胞癌有人乳头瘤病毒的感染，而高危型人乳头状瘤病毒的持续感染是宫颈癌发病的重要因素。

人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses，HPV)属乳多空病毒科A亚群内的一组DNA病毒，外形呈20多面体对称型，无包膜，直径约45nm～55nm，基因组为共价闭合环状双链DNA分子，含近8000个碱基对(bp)。HPV基因组含8个开放读码框架；可分为三个基因区，包括两个编码区和一个非编码调控区。编码区分为E区和L区，E区包括E1、E2、E4、E5、E6、E7；L区包括L1、L2，分别编码早期蛋白和晚期蛋白，六个E蛋白主要负责病毒DNA的复制、转录和细胞转化，两个L蛋白为衣壳蛋白主要负责病毒颗粒的组装和DNA包装。

当分离株病毒L1区序列与已知序列近源病毒株同源性少于90％时，就可被确定为一种新的HPV型别，按照HPV亚型与癌症相关性的高低将HPV分为高危型和低危型。高危型HPV包括HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82；可能的高危型包括HPV26、53和66；低危型包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81和CP6108。HPV与多种疾病密切相关，低危型HPV能引起良性生殖器疣；而高危型HPV则可引起宫颈癌、外生殖器癌及高度子宫颈上皮内瘤等恶性病变。因此，HPV感染的检测和分型对了解女性生殖道肿瘤相关病情、判断预后、指导治疗、分析HPV流行状况以及基因疫苗的研制均具有重要价值。

由于HPV具有高度种属特异性，难以在体外常规细胞培养系统中培养，也不能通过分离病毒来确定型别，目前缺少一种可行的血清学技术检验手段，因此，HPV的检测只能依赖对其DNA序列的分子水平的检查。

第二代杂交捕获法(hybrid caputure II，HC-II)是经美国FDA认证的可应用于临床的HPV DNA检测技术，HC-II采用孔平板法，可一次检测13种高危型HPV病毒(包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、69)型，具体操作步骤：样本DNA双链被释放并分解为核苷酸单链。DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交体。特异性抗体将RNA-DNA杂交体固定在微孔壁上。结合有碱性磷酸酶的多个二抗与RNA-DNA杂交体结合，放大信号。碱性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强弱确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂交体的含量。检测结果的判断标准是RLU(相对光单位，光信号)/Cutoff(域值＝三个阳性质控指标的平均值)≥1为阳性，＜1为阴性。HC-II检测灵敏度高、重复性好且客观性强，然而缺点是无法明确宫颈病变中感染的HPV型别。