[发明专利]含有非天然氨基酸的蛋白质的无细胞合成

说明书

发明背景

蛋白质合成是一种基础生物过程、是开发多肽治疗、疫苗、诊断和工 业酶的基础。随着重组DNA(rDNA)技术的出现、可以利用细胞的催化机器 来产生所需的蛋白质。这可利用衍生自细胞的提取物在细胞环境内或体外 实现。

无细胞蛋白质合成提供优于体内蛋白质表达方法的一些优点。无细胞 系统可使大多数(如果不是所有的)细胞代谢原料用于专门产生一种蛋白质。 此外，在体外没有细胞壁也具有优点，因为这能控制合成环境。例如，可 改变tRNA水平来反映待表达基因的密码子使用。由于无需考虑细胞的培 养或存活，所以改变氧化还原电位、pH或离子强度也可能比体内更加易行。 此外，可以容易地实现纯化的、适当折叠的蛋白质的直接回收。

认为体外翻译还能够掺入非天然的及同位素标记的氨基酸，和能够产 生在体内不稳定、不溶或有细胞毒性的蛋白质。此外，无细胞蛋白质合成 对改革蛋白质工程和蛋白质组筛选技术可能起作用。无细胞方法绕过克隆 和转化细胞以在体内表达新基因产物所需的艰苦费力过程，从而成为该领 域的技术平台。

相关文献

2006年5月16日批准的美国专利7,045,337，通过引用纳入本文作参考。

美国专利6,337,191B1；Swartz等，美国专利公开申请20040209321；Swartz 等，国际公开申请WO 2004/016778；Swartz等，美国专利公开申请 2005-0054032-A1；Swartz等，美国专利公开申请2005-0054044-A1；Swartz等， 国际公开申请WO 2005/052117。Calhoun和Swartz(2005)Biotechnol Bioeng 90(5)：606-13；Jewett和Swartz(2004)Biotechnol Bioeng 86(1)：19-26；Jewett等 (2002)原核体外表达系统(Prokaryotic Systems for In Vitro Expression)。刊于： Weiner M，Lu Q编辑的《基因克隆和表达技术》(Gene cloning and expression technologies).Westborough，MA：伊顿出版社(Eaton Publishing).第391-411页 ；Lin等(2005)Biotechnol Bioeng 89(2)：148-56.(Wang等(2001)Science 292(5516)：498-500；Wang等(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100(1)：56-61； Chin等(2002)J Am Chem Soc 124(31)：9026-7；Farrell等(2005)Nat Methods， 2005.2(5)：377-84；Liu等(2003)J Am Chem Soc 125(7)：1702-3。

发明概述

提供使用来自多核苷酸模板细菌细胞提取物进行高产量无细胞蛋白质合 成的方法，其中对合成蛋白质进行修饰使其含有一个或多个位点特异性掺入的 非天然氨基酸。蛋白质在包含至少一种非天然氨基酸氨酰化的正交tRNA的无 细胞反应混合物中合成，其中正交tRNA碱基对携带的密码子通常不与氨基酸 关联，如终止密码子、4bp密码子等。反应混合物还包含能够用非天然氨基酸 氨酰化正交tRNA的tRNA合成酶。正交tRNA合成酶易于被细菌细胞提取物 中的蛋白酶降解，通常外源性合成正交tRNA合成酶并在启动多肽合成前加入 反应混合物。正交tRNA可在获取细胞提取物的细菌细胞中合成，可在多肽反 应过程中从头合成，或可外源性加入反应混合物中。

本发明提供大量生产活性修饰蛋白质的方法。由此生产的蛋白质，包括含 二硫键的蛋白质、分泌蛋白质、膜结合蛋白质和多聚蛋白质等具有生物学活性。 在一些实施方式中，通过偶联的转录和翻译反应进行合成。

在一个实施方式中，合成反应条件能在体外激活氧化磷酸化。氧化磷酸化 激活的证据是合成对电子传递链抑制剂的敏感。此类反应基本不用聚乙二醇。

所述无细胞蛋白质合成体系提供了用于表达含非天然氨基酸蛋白质的灵 活的平台。在各种实施方式中，改进该体系以得到特定结果。根据期望的改进， 来改变非天然氨基酸的数目和特性。正交tRNA和tRNA合成酶可来自数种来 源，包含细菌、古细菌或哺乳动物。