[发明专利]含有非天然氨基酸的蛋白质的无细胞合成

权利要求书

1.一种在无细胞体外反应中合成多肽的方法，该多肽包含至少一个位 点特定的非天然氨基酸，所述方法包括：

在无细胞体外翻译反应混合物中合成所述多肽，所述反应混合物包含 与无义密码子形成碱基配对的正交tRNA、细菌细胞提取物、多肽和/或 mRNA合成机器组分；所述多肽的转录模板；合成所述多肽的单体；翻译 所需的辅因子、酶和其它试剂；

其中所述反应混合物包含浓度至少10μg/ml外源性合成的正交tRNA 合成酶，所述正交tRNA合成酶能用非天然氨基酸氨酰化正交密码子；其 中合成所述多肽使其含有至少一个位点特定的非天然氨基酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加入所述反应混合物的所 述外源性合成的正交tRNA合成酶的浓度为至少30μg/ml。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正交tRNA由作为所 述细菌细胞提取物来源的细菌内源性合成。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应混合物产生至少 约50μg/ml含至少一个位点特定的非天然氨基酸的蛋白质。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含至少一个位点特定 的非天然氨基酸的蛋白质中至少50％具有生物学活性。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含至少一个位点特定 的非天然氨基酸的蛋白质由偶联的转录翻译反应合成。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正交tRNA与终止密 码子形成碱基配对。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述无细胞体外翻译反 应中，氧化磷酸化是激活的。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述无细胞体外翻译反 应中加入外源性膜小泡。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含至少一个位点特 定的非天然氨基酸的蛋白质为膜结合蛋白。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含至少一个位点特 定的非天然氨基酸的蛋白质为分泌蛋白。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含至少一个位点特 定的非天然氨基酸的蛋白质含有至少一个二硫键。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽为病毒外被蛋 白。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，合成两种或更多种外 被蛋白。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述病毒外被蛋白是 噬菌体外被蛋白。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述噬菌体是MS2。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸是修 饰的苯丙氨酸或酪氨酸。

18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸选自 对-乙酰基-苯丙氨酸、对-乙炔基-苯丙氨酸、对-炔丙基氧基苯丙氨酸或对- 叠氮基-苯丙氨酸。

19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无细胞体外翻译反 应包含衍生自ompT-突变细菌菌株的细菌提取物。