[发明专利]一种天然2－苯乙醇的制备方法

权利要求书

1.一种天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于该方法为：以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)经过扩大培养的种子液为生物催化剂，所述的种子液接种于转化培养基，再加入酶催化法或微生物发酵法生产的L-苯丙氨酸为底物，在有机溶剂存在的条件下进行摇床振荡或通气搅拌转化，温度控制在25～30℃，转化18～24h，转化液后处理得到天然2-苯乙醇，所述的L-苯丙氨酸加入浓度以培养基体积计为10～20g/L，所述的有机溶剂为油酸或聚丙二醇。

2.如权利要求1所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述种子液接种于转化培养基的接种量为5～10％体积比，所述的种子液菌体浓度为稀释20倍后OD₆₆₀＝0.4～0.6。

3.如权利要求1所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述转化培养基组成为：蔗糖100～140g/L，酵母浸出粉5.0～7.5g/L，KH₂PO₄ 7.5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 12.6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，溶剂为水，pH自然。

4.如权利要求1所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述有机溶剂的体积用量与转化培养基体积比为1∶1～3。

5.如权利要求1所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述酿酒酵母是安琪酒精活性干酵母经分离纯化而获得，所述的分离纯化采用平板定向筛选法，即在平板培养基中加入3g/L的2-苯乙醇作为定向筛选的压力，抑制对2-苯乙醇耐受性差的菌株生长，选出用于2-苯乙醇生物转化合成的酿酒酵母。

6.如权利要求1所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述转化液后处理方法如下：先以4000r/min～5000r/min转速离心，使两相体系从上到下分为有机溶剂相、培养基相和酵母菌体三层，有机溶剂相中的2-苯乙醇采用减压蒸馏法分离，收集馏分得2-苯乙醇；培养基相中的2-苯乙醇采用有机溶剂萃取制得萃取液，萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得所述的2-苯乙醇，所述的有机溶剂为乙酸乙酯或乙酸丁酯。

7.如权利要求1所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述种子液按如下步骤制备得到：将酿酒酵母接种至斜面培养基，经活化培养得到斜面活化菌种，斜面活化菌种再接种至液体种子培养基，经过种子培养得到所述的酿酒酵母种子液。

8.如权利要求7所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述斜面活化培养方法为：将酿酒酵母接种于斜面培养基，于25～30℃的恒温培养24～36h得斜面活化菌种，所述斜面培养基组成为：葡萄糖10～20g/L，蛋白胨5～10g/L，酵母浸出粉3～5g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为水，pH自然。

9.如权利要求7所述天然2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述种子培养方法为：在无菌条件下用接种环挑取2～3环经斜面活化培养得到菌种到一级种子培养基中，于25～30℃旋转振荡培养箱中，150～250r/min振荡培养18～24h，获得一级种子液；再按5～10％体积比的接种量，将一级种子液接种至二级种子培养基于25～30℃下、150～250r/min振荡培养20～24h，得酿酒酵母种子液。所述一级种子培养基或二级种子培养基组成为：葡萄糖20～40g/L、蛋白胨10～20g/L、酵母浸出粉5～10g/L，溶剂为水，pH自然；

10.如权利要求1所述的天然2-苯乙醇制备方法，其特征在于所述方法按如下顺序步骤进行：

(1)斜面培养：将酿酒酵母接种于斜面培养基，于25～30℃的恒温培养24～36h，获得斜面活化菌种；斜面培养基组成为：葡萄糖10～20g/L，蛋白胨5～10g/L，酵母浸出粉3～5g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为水，pH自然；

(2)种子扩大培养：无菌条件下，以2～3环/40～50mL培养基的接种量，将斜面活化菌种接种至种子培养基，于25～30℃下、150～250r/min振荡培养20～24h，获得一级种子液；再按5～10％体积比的接种量，将一级种子液接种至二级种子培养基于25～30℃下、150～250r/min振荡培养20～24h，得酿酒酵母种子液，所述一级种子培养基或二级种子培养基组成为：葡萄糖20～40g/L、蛋白胨10～20g/L、酵母浸出粉5～10g/L，溶剂为水，pH自然；

(3)转化发酵：以步骤(2)制备的酿酒酵母种子液为生物催化剂，按5～10％体积比的接种量接种于转化培养基，再加入酶催化法或微生物发酵法生产的L-苯丙氨酸为底物，在有机溶剂存在的条件下进行摇床振荡或通气搅拌转化，温度控制在25～30℃，转化18-24h结束，得到含2-苯乙醇的有机溶剂/水的两相体系，所述的L-苯丙氨酸加入浓度以培养基体积计为10～20g/L，转化培养基的组成为：蔗糖100～140g/L，酵母浸出粉5.0～7.5g/L，KH₂PO₄ 7.5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 12.6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，溶剂为水，pH自然；所述有机溶剂的体积用量与转化培养基体积比为1∶1～3；

(4)发酵液预处理：将含2-苯乙醇的有机溶剂/水的两相体系离心，使两相体系分为有机溶剂相、培养基相和酵母菌体三层，将上层的有机溶剂相和中层的培养基相分别移出，用于2-苯乙醇的提取分离；

(5)2-苯乙醇的提取分离：有机溶剂相中的2-苯乙醇采用减压蒸馏法进行分离，收集馏分得2-苯乙醇；培养基相中的2-苯乙醇采用有机溶剂萃取制得萃取液，萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得2-苯乙醇，所述的有机溶剂为乙酸乙酯或乙酸丁酯。