[发明专利]乙肝病毒多态性检测芯片的制作方法及其应用

说明书

DNA芯片是随着“人类基因组计划”研究的发展应运而生的，它是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一。它是物理学、微电子学、化学与生命科学交叉综合的高科技。DNA芯片集成的不是电子元器件，而是利用或借助微电子芯片技术的集约化和平行处理原理，将大量具有生物学意义的特定序列的DNA片段有序地固化在硅衬底或玻璃上，利用DNA芯片，可快速、高效地获取大量的生命信息(包括基因识别、基因突变、基因测序和基因表达活性等)。它将对生命科学研究、医学诊断、新药筛选和新材料研究具有革命性的推动作用。也将对提高我国人口素质、健康水平、农业发展和环境保护等国家目标的实现作出巨大贡献。DNA芯片研究不仅具有重大的基础研究价值，而且具有巨大的商业化前景。

乙肝病毒是严重威胁我国人民身体健康的病原体微生物之一。我国约有1.2亿人口携带乙肝病毒，5岁以下幼儿感染乙肝病毒后转变为慢性乙肝患者可达30％，其中5-10％慢性乙肝患者将有可能发展成为肝硬化或肝癌。近十年来，通过接种乙肝疫苗在降低乙肝病毒感染率方面发挥了重要作用，但对乙肝的治疗和诊断方面进展不大。目前临床上诊断HBV感染的手段主要为检测HBV基因产物(HBsAg、HBeAg)及其抗体(Anti-HBs、Anti-HBc)的血清学方法及HBV DNA的斑点杂交和PCR法。近十年研究发现，HBV基因的多个位点如S、P及C基因区等易发生变异可导致HBV基因的多态性，给乙型肝炎的诊断、治疗和预防提出了新的问题，如漏检、疫苗免疫失败、耐药及临床病程变化等。因此，提供一种可具体反映HBV致病特征、耐药性、免疫逃逸等基因突变的基因诊断方法实为临床乙肝防治所必需。近年兴起的DNA芯片技术提供了检测乙肝病毒基因多态性的可能性，有可能成为协助临床诊断、治疗乙肝患者的有效手段。目前，国内研制的肝炎病毒检测芯片将乙肝病毒和丙肝病毒的保守序列固定在玻片上，只能检测出乙肝病毒或丙肝病毒，而不能检测出它们的分型。而本发明提供的乙肝病毒基因多态性检测芯片不仅可以检测是否有乙肝病毒和乙肝病毒的分型，而且可以获得发生突变的位点，以及有关的耐药性信息等，也可检测出丙肝分型，与传统的检测方法(血清学检测等)相比，具有速度快、正确率高、信息量大等优点，有利于临床确诊和提供疾病患者的治疗方案。

本发明的目的是提供乙肝病毒基因多态性检测芯片，具体地说，是根据乙肝病毒的基因分型、突变及耐药性信息设计均一的探针，然后将探针固定在修饰好的玻片上，用荧光标记、全基因扩增法扩增乙肝病毒DNA，然后与芯片杂交，从而得到乙肝病毒的相关信息，从而得到是否有乙肝病毒DNA，乙肝病毒DNA的基因分型，以及临床有意义的主要突变位点和耐药性信息等。

本发明的另一目的是提供上述芯片的制作方法及它的样品处理标记方法。

本发明的第三目的是上述所述芯片的应用。

乙肝病毒多态性检测芯片实质上是一种高密度的寡聚核苷酸(DNA探针)阵列，设计15-20聚针对相同突变位点、在中央位置有单碱基差异的寡核苷酸，且尽量将针对不同突变位点的寡核苷酸组的Tm值(解链温度)调整到大致相同。

  针对前核心区设计的探针为     长度         Tm

  TGGCTTTGGGGCAT               14           50

  TGGCTTTaGGGCATG              15           47.48

  TGGCTTTaGGaCATGGA            17           49.45

  GCTTTGGGaCATGGAC             16           48.1

另外，设计丙肝探针作为阴性对照。为了减少杂交的空间位阻，合成时，在寡核苷酸的5’端加一段polyT(连接臂)，连接臂的长度为8-20聚时，杂交效果好，最后为了使寡核苷酸能固定在玻片上，在寡核苷酸的5’端进行氨基修饰。

针对基因型区设计的探针为：          长度                Tm

ACCATGCAAGACCTGC                    16                 48.77

CATGCCGGACCTGC                      14                 50.47

TTCGCAAAATTCCTATG                   17                 47.41