本发明公开了一种制备ROSA26基因突变及肌内脂肪提高的动物的方法。本发明提供了突变ROSA26基因的方法，所述方法采用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括靶向ROSA26基因的sgRNA，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.1。该方法通过向受体细胞中导入sgRNA和Cas9以及含有PPARγ基因表达盒的供体DNA实现ROSA26基因的定点整合。实验证明，利用本发明的方法可以成功于ROSA26基因位点定点整合PPARγ2基因，最终成功得到表达PPARγ2的动物。
本发明公布了一种猪ROSA26特异性整合位点及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述，通过其衍生的打靶载体系列如SEQ ID NO.1所示。本发明采用的ROSA26特异性位点在猪或高等哺乳动物基因组中不会受到免疫介导的排斥和表观遗传修饰，能介导外源基因稳定高效的表达。提供的ROSA26特异性位点打靶载体可以高效特异的实现打靶。
本发明首先提供了特异性靶向小鼠ROSA26基因的sgRNA，其靶序列如SEQ ID NO.1所示，进而构建能同时表达所述sgRNA和Cas9蛋白的定点切割载体；本发明还构建了含有小鼠白细胞介素‑6和ROSA26基因同源序列的donor载体，在小鼠细胞SP2/0的ROSA26位点定点整合小鼠白细胞介素‑6，并通过筛选标记筛选获得纯合细胞系，获得高表达小鼠白细胞介素‑6的基因工程细胞株，本发明的细胞株可用于生产具有高比例分泌能力的杂交瘤细胞
