本发明提供了一种H-2Kd基因siRNA表达质粒及其制备方法与应用,该表达质粒包括序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸1和序列如SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸2配对结合而成的双链寡核苷酸,将合成的寡核苷酸1和寡核苷酸2等量混合,95℃作用3min,37℃孵育1h;将结合的双链寡核苷酸与带有BamHI和HindIII粘性末端的pSilencer3.0-H1载体连接,得到H-2Kd基因siRNA表达质粒。该H-2Kd基因siRNA表达质粒能用于抑制H-2Kd基因表达,为下一步研究H-2Kd基因的功能及制造外周血H-2Kd下降的动物模型奠定基础。