本发明属于生物技术领域,公开了一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板、体系及其用途。一种适于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板,所述线性DNA模板依次包括含有启动子的片段、限制性内切酶BsaI的编码基因和含有终止子的片段,所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述线性DNA模板不含有限制性内切酶BsaI的酶切位点。本发明的线性DNA模板,能有效防止线性DNA模板被核酸酶降解,其能够适用于任意的体外无细胞蛋白体系且能顺利表达,采用本发明的线性DNA模板进行体外无细胞蛋白合成,获得的限制性内切酶BsaI的纯度高、比活高
本发明提供了一种突变型限制性内切酶BsaI及其制备方法和应用,所述突变型限制性内切酶BsaI具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中任意一个:(I)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列;(II本发明通过对野生型限制性内切酶BsaI及进行多位点氨基酸突变,得到突变型限制性内切酶BsaI,所得酶稳定性好,酶活和纯度满足市场需要,且价格低廉。
本发明公开了植物单基因或多基因CRISPR激活技术的载体及构建方法、应用,所述载体为能表达sgRNA的TRV2载体;TRV2载体内包含表达sgRNA2.0的模块proPeBV‑BsaI‑BsaI‑sgRNA2.0,序列如SEQ ID NO.9所示;其中,两个BsaI位点为sgRNA插入位点,采用序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的引物扩增SEQ ID NO.9序列,并插入到TRV2载体多克隆位点