本发明公开了靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA及其应用。靶向敲除ALKBH3基因的sgRNA,选自ALKBH3sgRNA 102A或ALKBH3sgRNA 102B中的任意一种,所述的ALKBH3sgRNA 102A102A的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;所述的ALKBH3sgRNA 102B的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明提供针对不同ALKBH3外显子的sgRNA能有效靶向ALKBH3基因,将其构建进入CRISPR/Cas9系统,该系统能敲除ALKBH3基因,得到敲除ALKBH3基因的细胞株,从而有利于研究细胞株中ALKBH3基因的作用机制。