本发明公开了一种鱼露鲜味肽及其制备方法、鲜味强度评价方法和应用。本发明用膜超滤法、凝胶色谱法和反相高效液相色谱分离鱼露鲜味肽,Nano LC‑Q‑Orbitrap‑MS/MS鉴定肽分子量和序列。分析预测鲜味肽呈味强度,得到氨基酸序列如SEQ ID NO:1~5所示的鲜味肽,所述鲜味肽具有较好的鲜味及增鲜特性。本发明构建了单克隆化的人源T1R1/T1R3/G16gust44稳转细胞系,通过钙离子荧光成像技术检测不同浓度鲜味肽引起的细胞内钙离子荧光响应,以谷氨酸钠为标准品,谷氨酸钠和鲜味肽引起最强钙离子荧光变化时的浓度计算相对鲜度值,相对定量检测鲜味肽的鲜味强度,具有良好的重现性、稳定性和可靠性。