[发明专利]一种融合标签促进Kuma030蛋白酶可溶性表达及非亲和层析快速纯化的应用在审
申请号: | 201811468905.6 | 申请日: | 2018-12-04 |
公开(公告)号: | CN109517074A | 公开(公告)日: | 2019-03-26 |
发明(设计)人: | 易犁;刘厚权;喻婵;张桂敏 | 申请(专利权)人: | 湖北大学 |
主分类号: | C07K19/00 | 分类号: | C07K19/00;C12N15/70;C12N9/50;C12Q1/37 |
代理公司: | 北京精金石知识产权代理有限公司 11470 | 代理人: | 强红刚 |
地址: | 430062 湖北*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | 本发明属于分子生物学技术领域,提供了一种融合标签促进Kuma030蛋白酶可溶性表达及非亲和层析快速纯化的应用,其是将融合表达策略与Kuma030蛋白酶自身性质相结合,获得了一种融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法,该方法不仅能够促进蛋白酶高表达,而且还可以得到移除融合表达标签的纯蛋白,纯度高的同时具有更加简便、低耗的优点,更适用于大规模的工业应用。 | ||
搜索关键词: | 蛋白酶 可溶性表达 融合标签 融合表达 非亲和 层析 分子生物学技术 大肠杆菌 工业应用 自身性质 纯蛋白 高表达 移除 应用 标签 | ||
【主权项】:
1.一种融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:(1)通过三轮PCR扩增得到Sumo‑Kuma030片段,其中第一轮PCR扩增得到Kuma030片段,第二轮PCR扩增得到融合标签Sumo片段,第三轮通过连接PCR的方式将Sumo片段连接于Kuma030片段的N端,形成大片段Sumo‑Kuma030;(2)将步骤(1)获得的PCR产物Sumo‑Kuma030回收后,用限制性内切酶酶切,再将载体经过上述限制性核酸内切酶酶切后回收,与Sumo‑Kuma030酶连,得到表达载体pKuma030‑3(如图1所示);(3)将表达载体pKuma030‑3转化到大肠杆菌感受态细胞中,挑取转化子进行培养和诱导表达;(4)表达后收集菌体,去掉上清,水洗后用pH 6.8‑7.2、0.03‑0.08M Tris‑HCl缓冲液重悬菌体,加入溶菌酶,室温静置30‑50min,超声波破菌处理,离心破菌液,使破菌碎片与上清液完全分离,将上清液用HCl调pH至3.8‑4.0,去除沉淀,离心收集上清液并于52‑60℃水浴中处理20‑30min,离心收集上清。
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