[发明专利]一种融合标签促进Kuma030蛋白酶可溶性表达及非亲和层析快速纯化的应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，提供了一种融合标签促进Kuma030蛋白酶可溶性表达及非亲和层析快速纯化的应用，其是将融合表达策略与Kuma030蛋白酶自身性质相结合，获得了一种融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法，该方法不仅能够促进蛋白酶高表达，而且还可以得到移除融合表达标签的纯蛋白，纯度高的同时具有更加简便、低耗的优点，更适用于大规模的工业应用。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及融合标签促进蛋白质表达以及一种快速蛋白纯化方法在Kuma030表达纯化中的应用。

背景技术

乳糜泻(celiac disease,CD)是一种携带有遗传易感基因的个体因摄入含麦胶蛋白(即麸质gluten)的谷物(如小麦、大麦和黑麦，等)及其制品而引发的T细胞介导的系统性自身免疫病。Kumamolysin是一种可以降解麸质中PQ序列的一种蛋白酶。该蛋白酶具有独特的催化三联体(Glu78-Asp82-Ser278)，属于丝氨酸-羧基蛋白酶(S53)家族，且具有胶原蛋白酶活性。Kumamolysin蛋白酶由两部分组成：氨基端-前导肽(188个氨基酸)和成熟结构域(384个氨基酸)。当Kumamolysin蛋白处于酸性环境下(pH<4.0)，会发生自我切割现象(Okubo et al.2006)，由非成熟的完整形式变成具有催化活性的成熟形式(以下简称为Af-Kuma030，37kDa)。野生型KumaWT(Kumamolysin)经过两次蛋白质分子改造后得到高活性Kuma030突变体，其活性相对于野生型的KumaWT提高了800多倍。

2002年，Kumamolysin蛋白酶首次在大肠杆菌中克隆表达，但目标蛋白产量非常低，需要进一步浓缩之后才能在SDS-PAGE胶上检测到明显的条带(Oyama et al.2002)。2003年，Naoki Tsuruoka等将ScpA蛋白(后来被证实为Kumamolysin蛋白)在大肠杆菌中表达，最终得到的纯蛋白只有0.336mg/L(Tsuruoka et al.2003)。一方面，Kumamolysin蛋白在大肠杆菌中异源表达处于较低水平；另一方面，多步骤的非亲和层析纯化，例如阴阳离子交换、疏水作用等，使得最终纯蛋白的得率很低。因此，迫切需要解决该蛋白在大肠杆菌中低水平表达以及纯化产量低的问题。本发明人采用融合表达策略，利用能够促进蛋白质溶解、折叠的融合标签蛋白与Kumamolysin蛋白串联表达，使得蛋白产量提高到9.9mg/L。与此同时，发明人还采用一种快速高效的非亲和层析两步纯化方法，极大的简化了纯化步骤，提高了产品得率，相比于现行的纯化方法，更具大规模工业应用的潜力。

发明内容

鉴于Kuma030蛋白直接在大肠杆菌中异源表达水平较低以及多步骤的纯化方式，本发明提供了一种融合标签促进Kuma030蛋白酶表达以及一种两步纯化法的应用，能够在显著提高Kuma030蛋白酶表达量的同时，还能进一步快速纯化得到纯蛋白。

随着研究的深入，越来越多的融合表达标签被发现具有促进蛋白质折叠、可溶性表达的作用。然而，本发明人通过大量试验研究发现，现有的众多融合标签中，只有Sumo对Kuma030蛋白酶的表达具有明显的促进作用。另外，本发明人深入研究了Kuma030蛋白酶自身的性质，意外发现其在65℃高温、pH 4.0的环境中依然具有较高的活性。在进一步的研究中发现，酸性条件下，尤其是在pH不高于4.2时，Kuma030蛋白酶会进行自我切割，移除前导肽部分，形成具有催化活性的成熟肽，在此过程中，能够很好的移除位于目标蛋白N端的融合表达标签。因此，发明人构建了将具有促表达作用的融合标签Sumo序列连在Kuma030基因的N端的融合表达载体，在纯化过程中进行酸热两步处理时，一方面大量大肠杆菌内源蛋白在低pH环境变性沉淀；另一方面，Kuma030在酸的作用下进行自我切割，从而移除了在N端的融合标签，快速高效的得到了有活性的纯蛋白。

基于上述研究结果，本发明人利用融合表达策略以及结合Kuma030蛋白酶自身特性，最终提供了一种融合标签促进Kuma030蛋白酶表达以及二步非亲和层析纯化方式的应用。具体的技术方案概况如下：