[发明专利]一种融合标签促进Kuma030蛋白酶可溶性表达及非亲和层析快速纯化的应用在审
申请号: | 201811468905.6 | 申请日: | 2018-12-04 |
公开(公告)号: | CN109517074A | 公开(公告)日: | 2019-03-26 |
发明(设计)人: | 易犁;刘厚权;喻婵;张桂敏 | 申请(专利权)人: | 湖北大学 |
主分类号: | C07K19/00 | 分类号: | C07K19/00;C12N15/70;C12N9/50;C12Q1/37 |
代理公司: | 北京精金石知识产权代理有限公司 11470 | 代理人: | 强红刚 |
地址: | 430062 湖北*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 蛋白酶 可溶性表达 融合标签 融合表达 非亲和 层析 分子生物学技术 大肠杆菌 工业应用 自身性质 纯蛋白 高表达 移除 应用 标签 | ||
1.一种融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)通过三轮PCR扩增得到Sumo-Kuma030片段,其中第一轮PCR扩增得到Kuma030片段,第二轮PCR扩增得到融合标签Sumo片段,第三轮通过连接PCR的方式将Sumo片段连接于Kuma030片段的N端,形成大片段Sumo-Kuma030;
(2)将步骤(1)获得的PCR产物Sumo-Kuma030回收后,用限制性内切酶酶切,再将载体经过上述限制性核酸内切酶酶切后回收,与Sumo-Kuma030酶连,得到表达载体pKuma030-3(如图1所示);
(3)将表达载体pKuma030-3转化到大肠杆菌感受态细胞中,挑取转化子进行培养和诱导表达;
(4)表达后收集菌体,去掉上清,水洗后用pH 6.8-7.2、0.03-0.08M Tris-HCl缓冲液重悬菌体,加入溶菌酶,室温静置30-50min,超声波破菌处理,离心破菌液,使破菌碎片与上清液完全分离,将上清液用HCl调pH至3.8-4.0,去除沉淀,离心收集上清液并于52-60℃水浴中处理20-30min,离心收集上清。
2.根据权利要求1所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的载体为pET28a。
3.根据权利要求1所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的限制性核酸内切酶为NcoⅠ和XhoⅠ。
4.根据权利要求1所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法,其特征在于,步骤(3)中所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.根据权利要求1所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法,其特征在于,步骤(4)中所述的Tris-HCl缓冲液的pH为6.8-7.2,浓度0.03-0.08M。
6.根据权利要求1所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法,其特征在于,步骤(4)中所述破菌处理的方式为超声波破菌,超声3s停6s,采用200-400W功率破菌8-12min。
7.根据权利要求1所述融合标签促进Kuma030蛋白酶在大肠杆菌中可溶性表达并纯化的方法,其特征在于,步骤(4)中所述的水浴的温度为52-60℃。
8.一种利用权利要求1所述方法表达并纯化得到的Kuma030蛋白酶的活性检测方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)设计蛋白多肽底物MBP-Substrate-6xHis-GST,其中Substrate的序列如序列表中的序列1所示;
(2)取纯化得到的Kuma030蛋白酶与所述蛋白多肽底物,加入pH为3.8-4.0的醋酸钠缓冲液中混合,在36-38℃水浴中反应10-60min;
(3)反应结束后,取样用于SDS-PAGE检测,电泳结果显示为43kDa和26kDa两条带。
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