[发明专利]逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法

摘要

本发明的制备方法采用克隆PCV2 Cap基因杆状病毒表面展示载体连接，并加上哺乳动物启动子CAGG及报告基因eGFP获得重组转移载体；重组转移载体通过Tn7转座获得重组杆状病毒Bacmid载体；重组Bacmid用脂质体方法转染昆虫细胞，收集培养物上清，获得重组杆状病毒，重组杆状病毒感染昆虫细胞，收集细胞做Western blot分析和共聚焦显微镜分析；并把重组杆状病毒与猪血清作用，发现了与不展示Cap的病毒相比具有很强的逃逸补体清除的能力，从而提高疫苗免疫效力。

主权项

1.一种逃逸哺乳动物血清清除重组杆状病毒疫苗载体的制备方法，通过以下步骤完成：1) 克隆PCV2 Cap基因，与杆状病毒表面展示载体连接，CAGG启动子与eGFP的连接，并与表面展示载体相连，获得重组转移载体；2) 重组转移载体通过Tn7 转座获得重组杆状病毒Bacmid 载体；3) 重组Bacmid 用脂质体方法转染昆虫细胞，收集培养物上清，获得重组杆状病毒，观察细胞病变并提取病毒DNA 做PCR 鉴定；4) 重组杆状病毒感染昆虫细胞，收集细胞做Western blot 分析和共聚焦显微镜分析；5) 重组杆状病毒做补体拮抗活性检测；其中步骤1）具体为以PCV2病毒DNA提取物为模板，以Cap‑F和Cap‑R为引物扩增Cap基因，并加上NheI，SacI酶切位点，然后连到pFBDM带有GP64SP和GP64TM‑CTD和VSVG‑ED的表面展示载体骨架上得到pSur‑VSVG‑ED‑Cap，再从TRIP‑CAGG上将CAGG启动子切下来，连到带有eGFP的载体上得到包含CAGG‑eGFP的载体,最后将CAGG‑eGFP酶切连到pSur‑VSVG‑ED‑Cap上得到pSur‑VSVG‑ED‑Cap‑CAGG‑eGFP；所述Cap‑F序列为5’‑GCTAGCATGACGTATCCAAGGAGGC‑3’；所述Cap‑R序列为5’‑GAGCTCAGGGTTAAGTGGGGGGTCT‑3’。