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[发明专利]非洲猪瘟病毒C717R蛋白作为免疫诱导剂或者佐剂的应用-CN202310138735.X在审
发明人：郑海学;马旭升;尚小粉;辇晓峰;李茜;朱紫祥;茹毅;罗志宽;杨帆;张克山;田宏;代军飞;冯涛;王琦;曹伟军;党文;唐静 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2023-01-30 - 公布日： 2023-06-09 - 主分类号： A61K39/39 文献下载
摘要：本发明属于病毒免疫学领域，尤其是涉及非洲猪瘟病毒C717R蛋白作为免疫诱导剂或者佐剂的应用。具体如：ASFV C717R蛋白可作为免疫应答诱导剂或佐剂进行应用；ASFV C717R蛋白还可以作为炎症应答的激活剂进行应用。本发明将ASFV C717R重组慢病毒感染小鼠后，发现小鼠血清和动物组织的炎性细胞因子产生且分泌上调。本发明为为ASFV的防控以及C717R蛋白可以作为佐剂激活炎症反应提供了新的支持。
非洲猪瘟病毒 c717r 蛋白作为免疫诱导剂或者佐剂应用

[发明专利]口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测体系和方法的建立-CN202110550305.X在审
发明人：汪洋;张杰;侯谦;马维民;何继军;代军飞;李茜;李苗苗;爱斯纳非.科友斯.伍赛特;陈达年;丁耀忠;刘永生;张永光 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2021-05-19 - 公布日： 2021-10-29 - 主分类号： C12Q1/70 文献下载
摘要：本发明公开了FMDV可视化RT‑LAMP检测方法的建立。以合成的39条3D‑T7序列的体外RNA转录本为模板，对RT‑LAMP引物、引物浓度、反应时间、反应温度和显色剂等进行了筛选。建立了FMDV的RT‑LAMP检测方法，总体系为20μL，包括RT‑LAMP缓冲液15.2μL，BstAMV酶混合液1.5μL，外引物F3和B3各0.04μL(100μM)，内引物FIP和BIP各0.5μL(100μM)，环引物Floop和Bloop各0.11μL(100μM)，中性红1μL(500μM)，模板1μL。反应时间55min，反应温度65℃。反应结束后，若反应管溶液变为粉红色判为阳性，若为橘黄色则判为阴性。该方法特异性强，不与BVDV、ORFV、SPPV/GTPV、SVDV、BTV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV和PCV等病毒发生反应。建立的FMDV可视化RT‑LAMP方法为基层现场检测奠定了基础，以达到快速诊断FMDV的目的。
口蹄疫病毒可视化 rt lamp 检测体系方法建立

[实用新型]动物采血手术固定架-CN202022231512.2有效
发明人：汪洋;张杰;李苗苗;侯谦;李茜;陈娇;代军飞;刘永生 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2020-10-09 - 公布日： 2021-07-30 - 主分类号： A61D3/00 文献下载
摘要：本实用新型公开了一种动物采血手术固定架，包括底板、侧板、主升降柱、辅助升降杆、侧板转轴、头部固定板、万向轮、支架和中轴，所述主升降柱位于支架上面中心位置，所述底板位于主升降柱上面，所述底板两侧通过侧板转轴连接侧板；所述底板前面设有中轴，所述中轴前端通过横向转轴连接头部固定板；所述支架下面四个角设有万向轮。本实用新型动物采血手术固定架，可移动，可根据小动物(兔子，小猪，豚鼠等)个体随意调整；侧板可以各个角度放置，利于各种操作需求；头部固定装置可以随意调整；操作台高度可以调整，适于不同身高操作者；方便了动物采血诊疗工作。
动物采血手术固定

[发明专利]一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法-CN202110426713.4在审
发明人：欧云文;潘琴;张杰;王勤;刘俐君;代军飞;石义成;任绍科;邓书明 -专利权人：开江县动物疫病预防控制中心
申请日： 2021-04-20 - 公布日： 2021-07-23 - 主分类号： C07K16/08 文献下载
摘要：本发明公开了一种兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体及其制备方法，根据GenBank公布的PPV6流行毒株基因组序列设计1对特异性引物，构建pET30a‑PPV6‑VP2重组表达载体，IPTG诱导表达，Ni‑NTA树脂亲和层析纯化，不同梯度尿素透析复性，并与弗氏佐剂1:1混匀乳化，制备PPV6重组VP2蛋白免疫原。经背部皮下多点注射新西兰大耳白兔，制备高免血清，采用饱和(NH4)2SO4盐析方法纯化抗体。制备的兔源抗猪细小病毒6型VP2蛋白抗体纯净性好，无菌、无支原体、无外源病毒污染；特异性好，不含有除猪细小病毒6型VP2蛋白抗体外的其他猪常见病原抗体。以上特征充分满足了外源病毒检验用阳性血清的要求，对于兽用生物制品行业的健康发展具有重要意义。
一种兔源抗猪细小病毒 vp2 蛋白抗体及其制备方法

[实用新型]一种适用于手动纯化蛋白的纯化柱支架-CN202022233450.9有效
发明人： 代军飞;张杰;汪洋;刘永生;李茜;侯谦;马炳 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2020-10-09 - 公布日： 2021-01-08 - 主分类号： C07K1/14 文献下载
摘要：本实用新型公开了一种适用于手动纯化蛋白的纯化柱支架，包括支架、液体收集板滑槽、上固定圆孔、废液槽、底座；所述支架位于底座上面，支架为门型，包括两侧立柱和上部横梁；上部横梁上均布设有一排上固定圆孔，上固定圆孔为通孔；两侧立柱中间位置设有纵向液体收集板滑槽，纵向液体收集板滑槽内侧设有纵向滑道；液体收集板中部凸缘位于纵向滑道内；两侧立柱内侧设有废液槽，废液槽为长方形盘状。本实用新型适用于手动纯化蛋白的纯化柱支架，用于固定纯化柱，固定后易收集液体，满足实验需要，是一种适合不同规格的纯化柱固定架。
一种适用于手动纯化蛋白支架

[发明专利]一种猪圆环病毒3型的可视化LAMP检测试剂盒-CN202011070808.9在审
发明人：张杰;汪洋;丁耀忠;张维兵;李彦;马炳;代军飞;李茜;侯谦;李苗苗;孙跃峰;陈豪泰;刘永生;张永光 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2020-10-09 - 公布日： 2021-01-05 - 主分类号： C12Q1/70 文献下载
摘要：本发明公开了一种猪圆环病毒3型的可视化LAMP检测试剂盒，该试剂盒是包含有6条LAMP引物的LAMP反应液构成的检测体系。本发明的试剂盒以中性红为显色染料，使肉眼直观效果更加鲜明，阳性反应为粉红色，阴性反应为橘黄色，而且还实现了由试剂盒直接提供含有颜料的反应预混缓冲液的需求，这样不仅简化了操作程序，还有效避免污染发生。应用本发明的试剂盒进行检测，不仅能够以从临床样品中提取的DNA为扩增模板，而且还能够直接以全血或者血清为模板扩增，反应结果直接肉眼观察判断，具有良好的特异性和敏感性，需求设备简单(恒温热块即可)，操作便捷，不需要特殊技术人员，适于各种检测环境，尤其是现场使用。
种猪圆环病毒可视化 lamp 检测试剂盒

[发明专利]嵌合南非2型口蹄疫病毒多表位基因猪细小病H毒样颗粒的制备方法及应用-CN202010651532.7在审
发明人：张杰;丁耀忠;马维民;李茜;代军飞;汪洋;李国秀;侯谦;马炳;李苗苗;刘永生;张永光 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2020-07-08 - 公布日： 2020-10-20 - 主分类号： C12N15/866 文献下载
摘要：本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白Loop2区和Loop4区后嵌入SAT2FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYAD TNHTLPPTFNFGYVTVDK)，N端嵌入两个T细胞表位(NVQEGRRKHTDVAFLLDRST)串联。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因GS1927OP，克隆到载体pFastBacTMDual上，转化感受态细胞DH10Bac，获得重组杆粒rBacmidN(T1)2L2B4B，转染sf9细胞收获重组杆状病毒rBacN(T1)2L2B4B，用其感染HF细胞，使用间接免疫荧光IFA针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，具有特异性荧光。Western‑blot针对B、T细胞表位和VP2蛋白进行检测，在72KDa出现一条特异性条带。透射电镜TEM观察，重组蛋白N(T1)2L2B4B能够自我组装成病毒样颗粒。本发明旨在为南非2型口蹄疫制备储备疫苗，并能在此基础上达到同时预防南非2型口蹄疫和猪细小病的目的。
嵌合南非口蹄疫病毒多表位基因细小颗粒制备方法应用

[发明专利]展示南非2型口蹄疫病毒B细胞表位猪细小病毒样颗粒的制备方法-CN202010651527.6在审
发明人：李苗苗;丁耀忠;马维民;李茜;汪洋;马炳;侯谦;代军飞;刘永生;张杰;张永光 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2020-07-08 - 公布日： 2020-10-16 - 主分类号： C12N7/01 文献下载
摘要：本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白表面Loop2区嵌入SAT2 FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNFGYVTVD)。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因GS1921OP，克隆到载体pFastBacTMDual上，转化感受态细胞DH10Bac，获得重组杆粒rBacmidL2B，转染sf9细胞收获得重组杆状病毒rBacL2B。使用间接免疫荧光针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，具有特异性荧光。West ern Blot针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，在67KDa出现一条特异性条带。重组嵌合蛋白L2B能够自我组装成病毒样颗粒(Virus‑like Particles，VLPs)。本发明可应用在为南非2型口蹄疫制备储备疫苗，并能在此基础上达到同时预防南非2型口蹄疫和猪细小病的目的。
展示南非口蹄疫病毒细胞表位猪细小病毒颗粒制备方法

[发明专利]展示南非2型口蹄疫病毒B细胞表位和T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的制备及应用-CN202010651533.1在审
发明人：汪洋;马维民;丁耀忠;李茜;代军飞;马炳;侯谦;李苗苗;刘永生;张杰;张永光 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2020-07-08 - 公布日： 2020-10-16 - 主分类号： C12N7/01 文献下载
摘要：本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白Loop2区嵌入SAT2 FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNFGYVTVDK)，N端嵌入T细胞表位(NVQEGRRKHTDVAFLLDRST)。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因GS1923OP，克隆到载体pFastBacTMDual上，转化感受态细胞DH10Bac，获得重组杆粒rBacmidNT1L2B，转染sf9细胞，收获重组杆状病毒rBacNT1L2B，用其感染HF细胞，使用间接免疫荧光IFA针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，具有特异性荧光。We stern‑blot针对B、T细胞表位和VP2蛋白进行检测，在67KDa出现一条特异性条带。透射电镜TEM观察，重组蛋白NT1L2B能够自我组装成病毒样颗粒。本发明可应用在为南非2型口蹄疫制备储备疫苗，并能在此基础上达到同时预防南非2型口蹄疫和猪细小病的目的。
展示南非口蹄疫病毒细胞细小病毒颗粒制备应用

[发明专利]嵌合南非2型口蹄疫病毒抗原表位猪细小病毒样颗粒的组装方法及用途-CN202010652309.4在审
发明人：李茜;丁耀忠;马维民;代军飞;汪洋;侯谦;李苗苗;马炳;刘永生;张永光 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2020-07-08 - 公布日： 2020-10-16 - 主分类号： C12N7/01 文献下载
摘要：本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白表面Loop2区和Loop4区后分别嵌入SAT2 FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNFGYVTVDK)，在N端嵌一个T细胞表位(NVQEGRRKHTDVAFLLDRST)。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因GS1925OP，克隆到载体pFastBacTMDual上，转化大肠杆菌DH10Bac，获得重组杆粒rBacmidNT1L2B4B，转染sf9细胞，收获重组杆状病毒rBacNT1L2B4B，用其感染HF细胞，使用间接免疫荧光IFA针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，具有特异性荧光。Western‑blot针对B、T细胞表位和VP2蛋白进行检测，在70KDa出现一条特异性条带。透射电镜TEM观察，重组蛋白NT1L2B4B能够自我组装成病毒样颗粒。本发明可以应用在为南非2型口蹄疫制备储备疫苗，并能在此基础上达到同时预防南非2型口蹄疫和猪细小病的目的。
嵌合南非口蹄疫病毒抗原表位猪细小病毒颗粒组装方法用途

[发明专利]一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法-CN201911309242.8在审
发明人：汪洋;丁耀忠;李国秀;欧云文;代军飞;李茜;马炳;张杰;侯谦;刘永生 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2019-12-18 - 公布日： 2020-05-01 - 主分类号： C07K14/01 文献下载
摘要：本发明公开了一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，以PCV2毒株基因组为参考序列，在PCV2b的Cap蛋白编码基因上游偶联SUMO促溶表达标签编码基因，在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，优化基因，重组至PUC57质粒，以重组质粒为模板，设计特异性引物，经PCR扩增后产物克隆入pMAL‑C4x原核表达载体，构建重组质粒，转入大肠杆菌进行诱导、纯化。本发明成功构建了pMAL‑MBP‑HisSUMO‑Cap重组表达载体，MBP‑HisSUMO‑Cap融合蛋白在BL21(DE3)中可实现可溶性表达，纯化后MBP‑HisSUMO‑Cap融合蛋白作为免疫原，能与PCV2b阳性猪血清、兔抗MBP‑tag多克隆抗体和免疫小鼠抗血清均能发生特异性反应，表明其具有较好的免疫原性，为PCV2b诊断试剂盒的研发奠定了理论基础。
种猪圆环病毒 cap 蛋白可溶性表达方法

[发明专利]一种南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法-CN201911168275.5在审
发明人：马维民;何继军;李国秀;丁耀忠;张杰;李茜;汪洋;李苗苗;马炳;代军飞;刘永生;张维兵;李小云 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2019-11-25 - 公布日： 2020-04-03 - 主分类号： C12N15/66 文献下载
摘要：本发明公开了一种南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法，根据南非2型口蹄疫病毒基因序列，在FMDV SAT2的VP3蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，再根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO‑SAT2‑VP3基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO‑SAT2‑VP3‑PUC57质粒为模板，设计扩增南非2型口蹄疫病毒VP3基因的特异性引物，PCR扩增后用相同的限制性内切酶酶切目的片段与表达载体，之后将目的基因克隆入pET32a(+)原核表达载体，构建重组质粒pET32a‑HisSUMO‑VP3，转入大肠杆菌进行表达并对重组蛋白进行纯化。本发明成功构建了pET32a‑HisSUMO‑VP3原核表达载体，实现了在大肠杆菌中的表达，纯化后的目的蛋白具有较好的反应原性，为后续南非2型口蹄疫病毒亚单位疫苗的组装奠定基础。
一种南非口蹄疫病毒 vp3 基因可溶性表达方法

[发明专利]一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法-CN201911166768.5在审
发明人：丁耀忠;汪洋;李国秀;马维民;何继军;李茜;爱斯纳非.科友斯.伍赛特;代军飞;张杰;侯谦;马炳;李小云;刘永生;孙跃峰;吕建亮;邵军军;王永录;张忠旺;张永光 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2019-11-25 - 公布日： 2020-03-06 - 主分类号： C07K14/09 文献下载
摘要：本发明公开了一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法，以南非2型口蹄疫病毒基因组(JX014256)为参考序列，在FMDV SAT2的VP1蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，再根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO‑SAT2‑VP1基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO‑SAT2‑VP1‑PUC57质粒为模板，设计特异性引物；PCR扩增后利用相同的限制性内切酶酶切目的片段与表达载体，将目的基因克隆入pET32a(+)原核表达载体，构建重组质粒pET32a‑HisSUMO‑VP1，转入大肠杆菌诱导表达，利用镍柱进行纯化。结果表明HisSUMO‑VP1蛋白在大肠杆菌中能可溶性表达，纯化后的目的蛋白具有较好的免疫原性。本发明充分利用His与SUMO标签的优点，不仅提高Ni与组氨酸结合的特异性和稳定性，而且提高重组蛋白纯化效率。
一种南非口蹄疫病毒 vp1 基因可溶性表达方法

[发明专利]一种猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法-CN201911072955.7在审
发明人：汪洋;丁耀忠;李茜;张杰;爱斯纳非.科友斯.伍赛特;代军飞;李国秀;侯谦;马炳;刘永生;吕建亮;邵军军;刘新生;孙跃峰;潘丽;张永光 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2019-11-05 - 公布日： 2020-02-28 - 主分类号： C07K14/015 文献下载
摘要：本发明属于基因组装及免疫原性鉴定技术领域，公开了一种猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法，包括VP2基因的扩增，优化及重组供体质粒的构建；VP2重组穿梭质粒的构建与鉴定；重组杆状病毒的获得与鉴定；Western‑blot鉴定VP2蛋白的表达；VP2蛋白的间接免疫荧光鉴定；PPV‑AV30病毒纯化及鉴定；病毒样颗粒的组装及鉴定。本发明对蛋白进行翻译后加工修饰，展示目的蛋白的天然构象；本发明成功表达了PPV毒株AV‑30的蛋白VP2，并且正确组装成了VLPs，与天然病毒粒子PPV‑AV30相似，为下一步研究基于VLPs的亚单位疫苗或者制备嵌合型VLPs奠定了基础。
种猪细小病毒颗粒组装及其免疫原性鉴定方法

[发明专利]PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法-CN201810149238.9有效
发明人：张杰;张永光;丁耀忠;刘永生;代军飞;王俊;马炳;欧云文;孙跃峰;吕建亮;邵军军;周鹏 -专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所
申请日： 2018-02-13 - 公布日： 2019-10-18 - 主分类号： G01N33/68 文献下载
摘要：本发明公开了一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法，PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法包括(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSV N蛋白编码基因；(2)以MBP作为促溶标签，构建N蛋白原核表达载体；(3)MBP融合N蛋白表达与纯化；再通过间接ELISA抗体检测方法进行特异性试验。本发明以带有MBP标签的PMAL‑C4X作为表达载体，实现了PRRSV N蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，诱导培养在接近室温进行，无需加热或降温设备，目的蛋白洗脱采用10mmoL/L麦芽糖溶液，洗脱效果好，用量少，节约成本。本发明以融合N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法特异性强；本发明建立间接ELISA抗体检测方法与IDEXX同类试剂盒的总符合率为90％左右。
间接ELISA 抗体检测可溶性表达原核大肠杆菌密码子原核表达载体麦芽糖溶液特异性试验大肠杆菌包被抗原编码基因表达载体降温设备目的蛋白特异性强洗脱效果诱导培养试剂盒融合构建洗脱加热标签合成节约优化

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