[发明专利]高稳定性的人胰蛋白酶突变体有效
| 申请号： | 201510418411.7 | 申请日： | 2015-07-16 |
| 公开（公告）号： | CN106337043B | 公开（公告）日： | 2019-05-24 |
| 发明（设计）人： | 赵致;安少朋 | 申请（专利权）人： | 上海雅心生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/76 | 分类号： | C12N9/76;C12N15/57;C12P21/06 |
| 代理公司： | 上海专利商标事务所有限公司 31100 | 代理人： | 陈静 |
| 地址： | 201821 上海市嘉定区*** | 国省代码： | 上海;31 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | 本发明涉及高稳定性的人胰蛋白酶突变体。本发明人发现人阴离子胰蛋白的一些位点与其对热或pH值的稳定性相关，所述位点是第121位或第122位，在此基础上获得了一类人阴离子胰蛋白突变体，与野生型相比，所述突变体具有较高的稳定性。并且，在前述突变基础上结合人阴离子胰蛋白的第139位和206位的双突变，使得酶的稳定性和酶活性更为理想。 | ||
| 搜索关键词： | 稳定性 胰蛋白酶 突变体 | ||
【主权项】：
1.人阴离子胰蛋白酶的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，第121位由Ser突变为Ala、第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys和第122位由Arg突变为Leu。
下载完整专利技术内容需要扣除积分，VIP会员可以免费下载。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于上海雅心生物技术有限公司，未经上海雅心生物技术有限公司许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/patent/201510418411.7/，转载请声明来源钻瓜专利网。
- 上一篇：双碱基酶kex2变体及其高效表达方法
- 下一篇：凝血酶溶液
- 同类专利
- 一种胰蛋白酶及其制备方法与应用-201611051879.8
- 黄鹤;杜坤 - 天津大学
- 2016-11-24 - 2019-07-16 - C12N9/76
- 本发明涉及生物技术领域，提供了一种胰蛋白酶及其制备方法与应用。本发明所述胰蛋白酶其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述胰蛋白酶稳定性、活性高，且耐高温。本发明所述制备方法工艺简单，成本降低，获得胰蛋白酶纯度高，显著提高了猪源胰蛋白酶的应用价值。为进一步利用产蛋白酶的研究、开发、生产工作奠定了基础。
- 一种糜蛋白酶的纯化工艺-201711355040.8
- 刘乃山;孙永发 - 青岛冠龙生物制药有限公司
- 2017-12-16 - 2019-06-25 - C12N9/76
- 本发明公布了一种糜蛋白酶的纯化工艺。碎浆；盐析，过滤；加入硫酸铵至0.4饱和度，冷室中放置过夜；过滤，用50kDa的超滤膜进行超滤；用5‑10kDa的超滤膜进行超滤；滤液加硫酸铵至0.7饱和度，低温放置过夜；过滤，析晶；活化；沉淀；用10kDa的超滤膜进行超滤；SP离子交换柱纯化；用10‑30kDa的超滤膜进行超滤，除菌，即得。使用超滤膜与离子交换柱的结合来纯化糜蛋白酶，纯化效果好，得到的产品纯度高；本发明工艺得到的糜蛋白酶酶活性高，效价大于1500U/mg，可以减少用药量，减少患者医疗支出，也提高了该酶的用药安全性。
- 一种亲和层析分段洗脱纯化胰蛋白酶的方法-201711357829.7
- 刘乃山;夏衬来;张晓梦 - 青岛冠龙生物制药有限公司
- 2017-12-17 - 2019-06-25 - C12N9/76
- 本发明公开一种亲和层析分段洗脱纯化胰蛋白酶的方法，该方法通过以下工艺步骤：（1）多重结晶;（2）活化；（3）盐析；（4）超滤；（5）热原处理；（6）透析；（7）亲和层析；（8）冻干，制备胰蛋白酶。本发明对胰蛋白酶的生产工艺进行不断改进，特别是对各工艺参数进行反复的实验研究，不断优化，最终确立了一套更为科学的规模化生产工艺，经亲和层析纯化所得的胰蛋白酶的效价高达1600～1900iu/mg,并且各项指标均符合中国药典规定。
- 高稳定性的人胰蛋白酶突变体-201510418411.7
- 赵致;安少朋 - 上海雅心生物技术有限公司
- 2015-07-16 - 2019-05-24 - C12N9/76
- 本发明涉及高稳定性的人胰蛋白酶突变体。本发明人发现人阴离子胰蛋白的一些位点与其对热或pH值的稳定性相关，所述位点是第121位或第122位，在此基础上获得了一类人阴离子胰蛋白突变体，与野生型相比，所述突变体具有较高的稳定性。并且，在前述突变基础上结合人阴离子胰蛋白的第139位和206位的双突变，使得酶的稳定性和酶活性更为理想。
- 一种用于生产重组猪胰蛋白酶的发酵培养基-201811428317.X
- 马文柱 - 珠海冀百康生物科技有限公司
- 2018-11-27 - 2019-04-19 - C12N9/76
- 本发明公开了一种用于生产重组猪胰蛋白酶的发酵培养基，包括发酵培养基和补料培养基，其中发酵培养基包含有碳源、有机氮源、无机氮源、无机盐和水，补料培养基中包含有酵母浸粉和酵母蛋白胨。在本发明培养基下，胰蛋白酶原更为稳定，不容易出现自切割的问题，酶活测定激活时避免出现白色沉淀；而在胰蛋白酶产生活性时，可有效降低胰酶对菌体的损伤，避免发酵过程溶氧波动小，从而提高胰蛋白酶的表达水平和酶原纯度。
- 一种突变型Sus scrofa猪源胰蛋白酶及其编码基因及获取方法和应用-201510665921.4
- 黄鹤;杜坤;郭超;刘冶 - 天津大学
- 2015-10-15 - 2018-10-26 - C12N9/76
- 本发明涉及一种突变型Sus scrofa猪源胰蛋白酶及其编码基因及获取方法和应用，对原有的野生型Sus scrofa猪源胰蛋白酶酶进行突变，得到热稳定性显著提高的突变酶，提供编码上述胰蛋白酶突变体的编码基因、氨基酸序列和胰蛋白酶酵母工程菌的构建方法。氨基酸序列为SEQ ID NO.1；编码中所述蛋白质DNA序列为SEQ ID NO.2。本发明为生物法产蛋白酶的研究、开发、生产工作奠定了基础，有利于早日实现生物制革的清洁、低能耗，及皮革的生物安全性的生产。应用该菌种生产猪胰蛋白酶，产量相对较高、工艺相对简单，便于工业化应用。
- 一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用-201510083691.0
- 赵明治;徐平;吴飞林 - 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
- 2015-02-16 - 2018-06-12 - C12N9/76
- 本发明公开了一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用。采用本发明的制备方法制备的重组阳离子型猪胰蛋白酶和重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶具有高的酶活力，重组阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力为27800BAEE单位/mg酶；重组乙酰化阳离子型猪胰蛋白酶的酶活力为30200BAEE单位/mg酶；商品化猪胰蛋白酶的酶活力为9600BAEE单位/mg酶。本发明的制备方法具有酶产量高、特异性好、无动物来源病毒等有优点，生产与制备工艺简单、成本低，可以应用于生物制药和蛋白质组学研究。
- 一种高纯度胰蛋白酶的制备方法-201510102484.5
- 黄臻辉;汪雅雯;周伟洁 - 上海上药第一生化药业有限公司
- 2015-03-09 - 2017-11-24 - C12N9/76
- 本发明公开了一种高纯度胰蛋白酶的制备方法。该制备方法包括以下步骤(1)粗品溶解；(2)低pH孵放法灭活病毒；(3)疏水层析纯化；(4)酶原活化；(5)亲和层析纯化；(6)洗脱液除盐；(7)膜过滤去除病毒；(8)真空冷冻干燥，即得所述的高纯度胰蛋白酶。本发明的制备方法采用疏水层析纯化胰蛋白酶原，酶原激活后，亲和层析纯化胰蛋白酶，工艺较为简便，可以得到高纯度、高效价的胰蛋白酶。
- 一种高活性的胰蛋白酶的制备工艺-201610198288.7
- 黄金科 - 天津科仪嘉欣科技有限公司
- 2016-04-01 - 2017-10-24 - C12N9/76
- 本发明属于生物化学药物制药技术领域，具体涉及一种高活性的胰蛋白酶的制备工艺。通过将胰蛋白酶粗品进行溶解得到胰蛋白酶粗品溶解液；将胰蛋白酶粗品溶解液在60-70℃放置0.5-3小时；用磷酸盐缓冲液进行缓冲溶解，使其达到平衡；平衡后，向胰蛋白酶粗品溶解液中加入海藻酸钠和氯化钙溶液，搅拌均匀；向搅拌均匀的溶液中加入戊二醛进行反应，用水去除多余的戊二醛；将溶液装入透析袋，浸于外透液中，过滤得结晶物，加水溶解，调节pH值；将溶液透析，去除杂质；取出透析液，抽滤，得滤液，调节pH值，冻干后得结晶胰蛋白酶成品。能够提高胰蛋白酶的活性，提高工作效率。使得到的胰蛋白酶的活性达到4000U/mg以上。
- 一种人工设计自活化前导肽序列提高胰蛋白酶酶活的方法-201710256871.3
- 康振;张云丰;陈坚;堵国成;刘松 - 江南大学
- 2017-04-19 - 2017-06-27 - C12N9/76
- 本发明公开了一种人工设计自活化前导肽序列提高胰蛋白酶酶活的方法，属于基因工程领域。本发明构建的毕赤酵母工程菌，表达N端融合人工自活化前导肽序列TPAPPSDDLGTFDDDDK的胰蛋白酶。本发明得到的酵母工程菌GS115‑Sedeif的胰蛋白酶酶活(即胰蛋白酶酰胺酶酶活)达156U·mL‑1，酯酶酶活为15015.8U·mL‑1(以BAEE为底物)。是改造前的菌株胰蛋白酶酶活的1.82倍和3.29倍。该发明解决了胰蛋白酶异源表达量低的关键问题。应用该发明中的重组菌株生产胰蛋白酶，具产量高、发酵工艺简化、便于工业化应用的优点。
- 一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法-201710008963.X
- 林克;叶昀 - 宁波林叶生物科技有限公司
- 2017-01-04 - 2017-05-31 - C12N9/76
- 本发明涉及一种高活性胰蛋白酶的亲和层析制备方法，以牛胰或猪胰为原料，包括以下步骤原料粉碎；胰蛋白粗提；硫酸铵两级盐析；粗品酶解活化；以GE Health凝胶介质Sepharose CL‑4B为骨架，以(2，6‑二羟基)庚基‑(6‑氨基)乙酰基‑对氨基苯基胍为配基，在碱性条件下反应24h制备亲和层析填料进行亲和层析；超滤浓缩除菌；真空冷冻干燥得成品。本发明规避了传统工艺中繁琐的酶原沉淀步骤，大大简化了工序，同时能以较高的收率获得高纯度高活性的产品，工艺稳定，质量可控，大幅降低了生产成本，提高了产品的市场竞争力。
- 一种胰蛋白酶制备方法-201710047107.5
- 周爱武;张飞 - 上海交通大学医学院
- 2017-01-20 - 2017-05-31 - C12N9/76
- 本发明公开了一种胰蛋白酶制备方法，即利用Psumo3‑AMP载体将Sumo3标签蛋白第92位甘氨酸后连接胰蛋白酶的第24位异亮氨酸，过表达胰蛋白酶融合蛋白形成包涵体，然后将包涵体清洗、溶解和复性，最后将胰蛋白酶激活和纯化。本发明的优点在于(1)利用基因工程原理，利用大肠杆菌表达重组的胰蛋白酶，原料来源明确，蛋白质量可控；(2)采用Sumo3融合蛋白形式，经特异性高的Sumo特异性蛋白酶2(SENP2)切除Sumo3标签得到有生物活性的胰蛋白酶，本方法中胰蛋白酶的激活速率可控，折叠效率高且所得蛋白均一性好。
- 新的治疗-201580017331.9
- 马茨·彼得·卡尔松德;乌尔夫·托马斯·布洛姆 - 安吉酶迪卡公司
- 2015-01-29 - 2016-12-14 - C12N9/76
- 本发明提供了一种具有蛋白酶活性的多肽，用于治疗或预防患有或易患免疫缺陷的受试者中的微生物感染。例如，该多肽可以以口喷剂、鼻喷剂、含片、锭剂、口香糖或液体的形式给药，以治疗或预防原发性免疫缺陷患者的微生物感染。特别是，该多肽在治疗或预防鼻液溢和/或口腔和/或牙龈溃疡的真菌感染中是有用的。在一个实施方式中，该多肽是源自大西洋鳕鱼的胰蛋白酶，或其片段或变异体。
- 一种分级沉淀提取糜蛋白酶原的方法-201310643457.X
- 刘乃山;李静洁;刘君;刘振海 - 青岛康原药业有限公司
- 2013-11-30 - 2016-11-16 - C12N9/76
- 本发明公开了一种用分级沉淀提取糜蛋白酶原的方法，其原理在于高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化层，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。而硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。因此，本发明选择硫酸铵分级沉淀法对糜蛋白酶原提取工艺进行了研究、改进，使得制备糜蛋白酶原的收率提高到0.5％～0.6％。
- 一种糜蛋白酶的制备方法及提高糜蛋白酶复溶性的药物组合物-201510806704.2
- 刘乃山;林晓磊;刘翠珍 - 青岛康原药业有限公司
- 2015-11-21 - 2016-03-16 - C12N9/76
- 本发明阐述一种糜蛋白酶的制备方法及提高糜蛋白酶复溶性的药物组合物。该制备方法包括以下工艺步骤：（1）原料绞碎，抽提蛋白；（2）分级盐析，得糜蛋白酶粗品；（3）粗品投料，多重结晶；（4）活化；（5）盐析；（6）透析；（7）冻干。本发明建立起一套规模化的生产工艺，具有简单、低成本等优点，制备的糜蛋白酶精品效价高达1200单位/毫克以上，符合《中国药典》（2010版）要求，具有极大的市场竞争力。
- 一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法及提高糜蛋白酶稳定性的药物组合物-201510806701.9
- 刘乃山;林晓磊;刘翠珍 - 青岛康原药业有限公司
- 2015-11-21 - 2016-03-16 - C12N9/76
- 本发明公开一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法及提高糜蛋白酶稳定性的药物组合物，该方法通过以下工艺步骤：（1）多重结晶;（2）活化；（3）盐析；（4）超滤；（5）热原处理；（6）透析；（7）亲和层析；（8）冻干，制备糜蛋白酶。本发明对糜蛋白酶的生产工艺进行不断改进，特别是对各工艺参数进行反复的实验研究，不断优化，最终确立了一套更为科学的规模化生产工艺，经亲和层析纯化所得的糜蛋白酶的效价高达1500～1800iu/mg,并且各项指标均符合中国药典规定。
- 一种糜蛋白酶的制备方法及提高糜蛋白酶稳定性的药物组合物-201510806695.7
- 刘乃山;林晓磊;刘翠珍 - 青岛康原药业有限公司
- 2015-11-21 - 2016-03-16 - C12N9/76
- 本发明阐述一种糜蛋白酶的制备方法及提高糜蛋白酶稳定性的药物组合物。该制备方法包括以下工艺步骤：（1）原料绞碎，抽提蛋白；（2）分级盐析，得糜蛋白酶粗品；（3）粗品投料，多重结晶；（4）活化；（5）盐析；（6）透析；（7）冻干。本发明建立起一套规模化的生产工艺，具有简单、低成本等优点，制备的糜蛋白酶精品效价高达1200单位/毫克以上，符合《中国药典》（2010版）要求，具有极大的市场竞争力。
- 一种分离纯化胰蛋白酶的方法及提高胰蛋白酶复溶性的药物组合物-201510820580.3
- 刘乃山;林晓磊;刘翠珍 - 青岛康原药业有限公司
- 2015-11-24 - 2016-03-09 - C12N9/76
- 本发明公开了一种分离纯化胰蛋白酶的方法及提高胰蛋白酶复溶性的药物组合物，技术方案是将胰蛋白酶粗品溶解后，经盐溶、盐析，再用活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶，被激活的酶溶液再经结晶透析、冻干，获得较高纯度的胰蛋白酶。胰蛋白酶精品收率在6%以上，活性效价在2500iu/mg以上。
- 一种胰蛋白酶的制备方法及提高胰蛋白酶复溶性的药物组合物-201510820523.5
- 刘乃山;林晓磊;刘翠珍 - 青岛康原药业有限公司
- 2015-11-24 - 2016-03-09 - C12N9/76
- 本发明阐述一种胰蛋白酶的制备方法及提高胰蛋白酶复溶性的药物组合物。该制备方法包括以下工艺步骤：（1）原料绞碎，抽提酶原；（2）分级盐溶、盐析，得胰蛋白酶粗品；（3）粗品投料，多重结晶；（4）活化；（5）结晶；（6）透析；（7）冻干。本发明建立起一套规模化的生产工艺，具有简单、低成本等优点，制备的胰蛋白酶精品效价达2500单位/毫克以上，符合《中国药典》（2010版）要求，具有极大的市场竞争力。
- 一种从草鱼中提取纯化胰蛋白酶的方法-201510826574.9
- 刘乃山;于晓娜;刘翠珍 - 青岛康原药业有限公司
- 2015-11-25 - 2016-03-09 - C12N9/76
- 本发明公开了一种从草鱼中提取纯化胰蛋白酶的方法。本发明通过粗提液的制备、硫酸铵分级盐析、DEAE-Sephacel阴离子交换层析和Sephacryl-200凝胶过滤层析等提取纯化得到胰蛋白酶。该发明为胰蛋白酶的制备提供了一种新的材料来源，同时为草鱼内脏的合理回收及应用提供了理论依据。
- 一种制备胰凝乳蛋白酶的方法-201510826531.0
- 刘乃山;赵叶华;刘翠珍 - 青岛康原药业有限公司
- 2015-11-25 - 2016-03-02 - C12N9/76
- 本发明公开了一种制备胰凝乳蛋白酶的方法。本发明的技术方案是将动物胰脏经过绞碎，灵活运用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸缓冲液盐溶、硫酸铵盐析等现代蛋白纯化技术，制备胰凝乳蛋白酶。本发明操作简单、成本低，非常适用于规模化大生产。
- 一种消化酶组合物及成纤维细胞和饲养层细胞的制备方法-201510889246.3
- 陈海佳;葛啸虎;王一飞;罗二梅;张维敏 - 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
- 2015-12-04 - 2016-02-10 - C12N9/76
- 本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种消化酶组合物及成纤维细胞和饲养层细胞的制备方法。该消化酶组合物包括胰蛋白酶和分散酶。本发明消化酶组合物将胰蛋白酶和分散酶以一定比例联合使用后，在大大减少消化酶用量的情况下，反而可起到更好的消化效果，成纤维细胞的得率更高。
- 一种糜蛋白酶原的提取及纯化方法-201510686818.8
- 李家和;阳成成;冯争名 - 长沙仁泽生物技术有限公司
- 2015-10-22 - 2016-01-06 - C12N9/76
- 本发明涉及一种糜蛋白酶原的提取及纯化方法，包括下列步骤：（1）糜蛋白酶原的提取工艺；（2）采用基础层析介质与三聚氯氰反应活化后，与十一胺以及二异丁胺反应，合成亲和分离材料；（3）采用自我合成新型亲和分离材料纯化糜蛋白酶原。本发明较现有技术能更低成本、高效率的大规模生产具有高酶活的糜蛋白酶原。
- 注射用结晶糜胰蛋白酶-201510377310.X
- 俞水泉 - 俞水泉
- 2015-06-30 - 2015-11-25 - C12N9/76
- 本发明从我国丰富的猪胰资源出发，采用不同于提取牛糜蛋白酶、牛胰蛋白酶的工艺，解决了从猪胰中提取糜蛋白酶和胰蛋白酶共晶体的问题。本发明具有糜蛋白酶和胰蛋白酶二种酶协同水解蛋白质肽链的作用，抗原性小，毒副反应低，临床疗效好。1976年江苏省吴县制药厂由俞水泉带领的团队攻克了从猪胰中提取“注射用结晶糜胰蛋白酶”的创新技术。对此，1984年国家科委会颁发“国家发明四等奖”的奖励。1976年起，江苏省吴县制药厂随即投入了生产。连续生产八年之后，国内猪胰的屠宰、收购方式突然改变。猪胰收不到了，无奈，吴县制药厂也就被迫停止生产糜胰蛋白酶。30年过去了，国内外至今还没有单位从猪胰中直接提取生产“注射用糜胰蛋白酶”。
- 一种分离纯化胰蛋白酶的方法及含有胰蛋白酶的药物组合物-201410819332.2
- 刘乃山;林晓磊;刘翠珍 - 青岛康原药业有限公司
- 2014-12-25 - 2015-05-06 - C12N9/76
- 本发明公开了一种分离纯化胰蛋白酶的方法及含有胰蛋白酶的药物组合物，技术方案是将胰蛋白酶粗品溶解后，经盐溶、盐析，再用活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶，被激活的酶溶液再经结晶透析、冻干，获得较高纯度的胰蛋白酶。胰蛋白酶精品收率在6%以上，活性效价在2500iu/mg以上。
- 一种高效价胰蛋白酶-201410807828.8
- 刘乃山;王议锋;刘翠珍 - 青岛康原药业有限公司
- 2014-12-23 - 2015-04-22 - C12N9/76
- 本发明阐述一种高效价的胰蛋白酶的制备方法，其步骤如下：（1）原料绞碎，抽提酶原；（2）分级盐溶、盐析，得胰蛋白酶粗品；（3）粗品投料，多重结晶；（4）活化；（5）结晶；（6）透析；（7）冻干。本发明建立起一套规模化的生产工艺，具有简单、低成本等优点，制备的胰蛋白酶精品效价达2500单位/毫克以上，符合《中国药典》（2010版）要求，具有极大的市场竞争力。
- 一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法及含有糜蛋白酶的药物组合物-201410807818.4
- 刘冠男;林晓磊;刘翠珍 - 青岛康原药业有限公司
- 2014-12-23 - 2015-04-22 - C12N9/76
- 本发明公开一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法及含有糜蛋白酶的药物组合物，该方法通过以下工艺步骤：（1）多重结晶;（2）活化；（3）盐析；（4）超滤；（5）热原处理；（6）透析；（7）亲和层析；（8）冻干，制备糜蛋白酶。本发明对糜蛋白酶的生产工艺进行不断改进，特别是对各工艺参数进行反复的实验研究，不断优化，最终确立了一套更为科学的规模化生产工艺，经亲和层析纯化所得的糜蛋白酶的效价高达1500～1800iu/mg,并且各项指标均符合中国药典规定。
- 一种糜蛋白酶的制备工艺-201410807735.5
- 刘乃山;林晓磊;刘翠珍 - 青岛康原药业有限公司
- 2014-12-23 - 2015-04-22 - C12N9/76
- 本发明阐述一种糜蛋白酶的制备方法及含有糜蛋白酶的药物组合物。该制备方法包括以下工艺步骤：（1）原料绞碎，抽提蛋白；（2）分级盐析，得糜蛋白酶粗品；（3）粗品投料，多重结晶；（4）活化；（5）盐析；（6）透析；（7）冻干。本发明建立起一套规模化的生产工艺，具有简单、低成本等优点，制备的糜蛋白酶精品效价高达1200单位/毫克以上，符合《中国药典》（2010版）要求，具有极大的市场竞争力。
- 一种高产胰蛋白酶的酵母工程菌及其构建方法-201410614186.X
- 康振;陈坚;堵国成;张云丰;令桢民 - 江南大学
- 2014-11-04 - 2015-02-04 - C12N9/76
- 本发明公开了一种高产胰蛋白酶的酵母工程菌及其构建方法，属于基因工程领域。本发明构建的酵母工程菌，表达前端融合了硫氧还蛋白的胰蛋白酶，且在硫氧还蛋白与胰蛋白酶之间插入四个天冬氨酸和赖氨酸(D4K)。本发明的酵母工程菌，其胰蛋白酶酰胺酶酶活(BAPNA)47.4U/mL、酯酶酶活(BAEE)2667U/mL，解决了胰蛋白酶原活化、产量低的问题。应用该菌种生产胰蛋白酶，具有产量高、工艺简化、便于工业化应用的优点。
- 一种酶活提高的胰蛋白酶突变体及其构建方法-201410612164.X
- 康振;陈坚;张云丰;堵国成 - 江南大学
- 2014-11-04 - 2015-02-04 - C12N9/76
- 本发明公开了一种酶活提高的胰蛋白酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明的突变体是在序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将第1位的酪氨酸突变成了苯丙氨酸，同时将第123位的精氨酸突变成了异亮氨酸。本发明得到的突变体在毕赤酵母中表达，3L罐发酵酰胺酶(BAPNA)酶活为85.3U/mL,酯酶(BAEE)酶活为5954U/mL，相比突变前的菌株，酶活分别提高了3.3倍、2.7倍，解决了胰蛋白酶胞外酶活低的问题。应用该发明中的突变体生产胰蛋白酶，产量高、工艺简化、便于工业化应用。
- 专利分类
