[发明专利]一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法有效
申请号: | 201510340415.8 | 申请日: | 2015-06-18 |
公开(公告)号: | CN105018514B | 公开(公告)日: | 2019-01-01 |
发明(设计)人: | 李永泉;刘水平;卜庆廷;江辉 | 申请(专利权)人: | 浙江大学 |
主分类号: | C12N15/76 | 分类号: | C12N15/76;C12N15/52;C12P19/62;C12R1/465 |
代理公司: | 杭州求是专利事务所有限公司 33200 | 代理人: | 张法高;赵杭丽 |
地址: | 310027 浙*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | 本发明提供一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法。首先,基于诱导型启动子OROlac和强启动子ermEp*,首次在链霉菌中构建了梯度诱导表达体系。其次,通过梯度诱导控制靶基因表达量,偶联分析靶基因表达量与目标药物产量的关系,从而揭示药物生物合成途径中的限速反应及其限速酶的适配性。最后,通过组成型启动子ermEp*,理性串联高表达相关限速酶编码基因,获得了一株恰塔努加链霉菌高产菌株L12,送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号:CGMCC No.10157。摇瓶发酵结果显示L12中纳他霉素产量是恰塔努加链霉菌L10的3.3倍。50L发酵罐小试中,最高产量达到15.7 g/L。本发明方法高效、准确、操作简单,且普遍适用于其它链霉菌。 | ||
搜索关键词: | 一种 霉菌 药物 高效 生物 合成 构建 方法 | ||
【主权项】:
1.一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法,其特征在于,通过以下步骤实现:(1) 将报告基因egfp分别置于强启动子和阻遏蛋白控制的诱导型启动子后,构建梯度表达载体,分别通过结合转导整合至宿主链霉菌恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)L10基因组中;所述的诱导型启动子为OROlac,由SEQ ID NO:1 的核苷酸序列组成;强启动子为组成型启动子ermEp*,由SEQ ID NO:2 的核苷酸序列组成;所述恰塔努加链霉菌L10由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,分类命名:恰塔努加链霉菌,保藏号:CGMCC No.2644,保藏日期:2008年8月27日,保藏地址:北京市朝阳西路北展西路1号院3号中国科学院微生物研究所; (2) 无菌条件下,将步骤(1)处理的恰塔努加链霉菌L10接种于斜面培养基中,置于培养箱中培养,所述斜面培养基为:酵母提取物 4.0g/L,麦芽提取物 10.0 g/L,葡萄糖 4.0 g/L,琼脂糖 20.0 g/L,其余为水,pH 值调至6.0;(3) 斜面培养后,将培养好的孢子块接入盛有摇瓶种子培养基的三角瓶中,摇床培养18‑22小时,所述种子培养基为:葡萄糖 17.5g/L,蛋白胨15 g/L,NaCl 10 g/L,其余为水,pH自然;(4) 将步骤(3)所得的种子液转接至4%YEME培养基中, 12小时后加入诱导剂,继续摇瓶培养至48小时,所述4%YEME培养基为酵母提取物3.0g/L,麦芽提取物 3.0 g/L,蛋白胨 5.0 g/L,葡萄糖 40 g/L,其余为水,pH自然;(5) 吸取步骤(4)所得的链霉菌菌液,离心收集菌体,采用PBS缓冲液清洗菌体一次,加入蛋白裂解缓冲液和蛋白水解酶抑制剂,超声破碎细胞,4 °C、12000 r/min离心10 min,转移上清至新的1.5 ml离心管中,对蛋白进行定量后,取蛋白样品分别进行SDS‑PAGE和Western blotting检测,与此同时,取少量液体培养的链霉菌菌液,通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光强度;蛋白裂解缓冲液:PH 8.0的Tris HCl 50mM,NaCl 150mM,EDTA 5mM,Glycerol5%,Triton X‑100 1%;蛋白水解酶抑制剂:PMSF;(6) 分析不同诱导条件下和不同启动子活性下eGFP 的表达变化曲线,初步建立链霉菌梯度诱导表达体系;(7) 将四个限速酶编码基因:scnK、scnJ、scnC和scnD分别置于诱导型启动子和强启动子后,构建梯度表达载体,分别通过结合转导导入对应的靶基因缺失菌株中,构建突变菌株;所述四个限速酶编码基因:scnK、scnJ、scnC和scnD由SEQ ID NO:5‑8 的核苷酸序列组成,其中scnK、scnJ和scnC依次置于强启动子ermEp*后,scnD单独置于强启动子ermEp*后,通过两套整合酶体系整合至恰塔努加链霉菌L10的基因组中;(8) 偶联分析目的药物和靶基因的表达量的对应关系,揭示纳他霉素合成途径中的限速反应及其限速酶的适配性;(9) 将限速酶基因分别置于强启动子ermEp*后,构建载体,通过结合转导导入恰塔努加链霉菌L10中,获得恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis) L12;所述恰塔努加链霉菌株L12已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,其保藏号:CGMCC No.10157,分类命名:恰塔努加链霉菌,保藏日期:2014年12月11日,保藏地址:北京市朝阳西路北展西路1号院3号中国科学院微生物研究所;(10) 将恰塔努加链霉菌L12接种于种子培养基中,摇瓶培养18‑22小时后转接入新鲜的种子培养基中,形成二级种子液,其中的种子培养基同步骤(3);(11) 将步骤(10)中的二级种子液转接至发酵罐培养基中,控制发酵罐的各个参数,在不同的发酵时间点取样;发酵罐培养基:大豆蛋白粉20 g/L,酵母粉8 g/L,葡萄糖40 g/L,其余为水, pH自然;(12) 使用甲醇浸提发酵培养液中的纳他霉素,通过高效液相色谱检测其产量。
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- 本发明公开了一种链霉菌重组表达载体的构建及应用,属于基因工程领域。本发明提供的链霉菌表达载体,方便外源基因的插入及防止转录通读在载体上添加多克隆位点和终止子,且能够在三种链霉菌中大量分泌表达TGase。
- 一种四环素耐低氧菌种的构建方法-201410748432.0
- 张燕玉;马学霞;李学兵;孙瑞君;崔莉 - 宁夏启元药业有限公司
- 2014-12-09 - 2015-06-24 - C12N15/76
- 本发明涉及一种四环素耐低氧菌种的构建方法,其工艺包括:构建可表达透明颤菌血红蛋白基因的质粒pSET152;将上述构建的质粒pSET152转化入大肠杆菌PUZ8002中;将转化后的大肠杆菌PUZ8002与金色链霉菌进行接合转移,得到四环素耐低氧菌种。通过本发明方法构建的四环素耐低氧菌种可以改善重组四环素在低氧条件下的蛋白表达水平,最终达到节约能源,降低成本的目的。
- 构建产纤维素酶和纳他霉素的重组利迪链霉菌的方法-201410815297.7
- 吴慧玲;刘伟成;李锦锦;刘霆;董丹;张涛涛;卢彩鸽;张殿朋;刘德文;田兆丰 - 北京市农林科学院
- 2014-12-24 - 2015-04-01 - C12N15/76
- 本发明公开了构建产纤维素酶和纳他霉素的重组利迪链霉菌的方法。本发明所提供的构建产纤维素酶和纳他霉素的重组利迪链霉菌的方法中,构建产纤维素酶和纳他霉素的重组利迪链霉菌的方法,包括将血红蛋白的编码基因和纤维素酶的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到产纤维素酶和纳他霉素的重组利迪链霉菌的步骤;血红蛋白为A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.3的蛋白质,或A2)具有血红蛋白功能的由A1)衍生的蛋白质;纤维素酶为B1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.4的蛋白质,或B2)具有纤维素酶功能的由B1)衍生的蛋白质。
- 高效生防重组利迪链霉菌及其构建方法与应用-201410787505.7
- 吴慧玲;刘伟成;李锦锦;田兆丰;董丹;刘霆;张涛涛;卢彩鸽;张殿朋;刘德文 - 北京市农林科学院
- 2014-12-17 - 2015-04-01 - C12N15/76
- 本发明公开了高效生防重组利迪链霉菌及其构建方法与应用。本发明所提供的高效生防重组利迪链霉菌及其构建方法与应用中,构建重组利迪链霉菌的方法,包括将血红蛋白的编码基因和纳他霉素生物合成正调控因子的编码基因导入作为宿主菌的利迪链霉菌中筛选得到重组利迪链霉菌的步骤;血红蛋白是A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.3的蛋白质,或A2)具有血红蛋白功能的由A1)衍生的蛋白质:纳他霉素生物合成正调控因子为B1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.4的蛋白质,或B2)具有纳他霉素生物合成正调控因子功能的由B1)衍生的蛋白质。
- 产纤维素酶和产纳他霉素的重组利迪链霉菌与应用-201410815257.2
- 吴慧玲;刘伟成;李锦锦;刘霆;董丹;张涛涛;卢彩鸽;张殿朋;刘德文;田兆丰 - 北京市农林科学院
- 2014-12-24 - 2015-04-01 - C12N15/76
- 本发明公开了产纤维素酶和产纳他霉素的重组利迪链霉菌与应用。本发明所提供的重组利迪链霉菌的构建方法,包括将血红蛋白的编码基因和纤维素酶的编码基因的表达载体导入利迪链霉菌中,得到产纤维素酶和纳他霉素的重组利迪链霉菌的步骤;血红蛋白为A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.3的蛋白质,或A2)具有血红蛋白功能的由A1)衍生的蛋白质;纤维素酶为B1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.4的蛋白质,或B2)具有纤维素酶功能的由B1)衍生的蛋白质;所述表达载体从上游至下游的方向含有红霉素抗性基因启动子、所述纤维素酶的编码基因、所述红霉素抗性基因启动子、所述血红蛋白的编码基因。
- 大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体及其构建方法-201310083678.6
- 刘刚;戴素琴;陈惠鹏;邢玉华;张部昌 - 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
- 2013-03-15 - 2014-09-17 - C12N15/76
- 本发明涉及一种大肠杆菌-链霉菌穿梭型BAC载体及其构建方法,该BAC载体含有多克隆位点MCS,Am抗性基因,整合酶基因int,整合位点attp,接合转移片段oriT,BAC载体的复制区oriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC序列、cos位点和loxP位点。本发明从pBeloBAC11出发,用Red同源重组技术将其上的氯霉素抗性基因替换为用于接合转移(oriT)、定点整合(attp-int)和抗性筛选(Am)的oriT-attp-int-Am的DNA片段(称之为替换盒),得到载体pBTIBAC1,为实现大片段基因簇在链霉菌中的异源表达奠定了基础。
- 基于代谢调控高产土霉素的方法-201210550528.7
- 郭美锦;张嗣良;于岚;王龙;颜湘云;储炬;庄英萍;肖慈英 - 华东理工大学
- 2012-12-18 - 2014-06-18 - C12N15/76
- 本发明涉及基于代谢调控高产土霉素的方法。本发明公开了一种在龟裂链霉菌中通过调控土霉素合成途径提高土霉素产量的方法,通过增加一个或多个土霉素生物合成途径的调控因子的拷贝数,从而提高土霉素合成途径中相关基因的表达水平,进而提高土霉素的产量。
- 利用vgb基因构建的抗贫氧高密度发酵纳他霉素基因工程菌株及其应用-201310234364.1
- 刘飞;王绍花;朱希强;凌沛学 - 山东省生物药物研究院
- 2013-06-14 - 2014-02-05 - C12N15/76
- 利用vgb基因构建的抗贫氧高密度发酵纳他霉素基因工程菌株及其应用。本发明提供一种利用vgb基因构建的抗贫氧高密度发酵纳他霉素的基因工程菌株(Streptomyces gilvosporeus sw-807,CGMCC No.6890)。其利用透明颤菌血红蛋白基因vgb构建重组质粒,通过接合转移的方式将vgb基因整合入褐黄孢链霉菌基因组中,获得可直接用于纳他霉素发酵生产的重组基因工程菌株。重组菌中VHb的表达可有效解决纳他霉素发酵生产中的氧供求矛盾,大幅度提高纳他霉素的产量,降低生产成本,带来巨大的经济效益。
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