[发明专利]一种抗肿瘤化合物筛选模型的建立方法及其应用在审
| 申请号： | 201410442447.4 | 申请日： | 2014-09-02 |
| 公开（公告）号： | CN104593423A | 公开（公告）日： | 2015-05-06 |
| 发明（设计）人： | 姜钰超;易银沙;张万明;邹义洲;何彰华;孙永林;刘彩云;袁炳秋;吴小宁 | 申请（专利权）人： | 长沙赢润生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/89 | 分类号： | C12N15/89;A01K67/027;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 无 | 代理人： | 无 |
| 地址： | 410000 湖南省长沙市*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | 一种以体轴向背侧弯曲为标识的高通量逆转斑马鱼Sonic Hedgehog(Shh)信号通路过表达抗肿瘤化合物筛选模型的建立方法及其应用，属于医药技术领域技术创新，能够运用于潜在特异性的肿瘤抑制前导化合物的初步快速筛选。具体为讲斑马鱼tulp3基因作为靶基因，利用特异性Morpholino寡聚核苷酸序列将tulp3基因部分沉默，从而使Shh通路过表达。所述Shh通路过表达斑马鱼表现出体轴特异性向背侧弯曲的表型，此表型即为Sonic hedgehog通路过表达的标识。通过斑马鱼身体外观水平的观察就可以直观了解到Shh通路的过表达情况，相对于细胞模型更加直观和方便，有利于高通量筛选以Shh通路为靶点的药物。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 肿瘤 化合物 筛选 模型 建立 方法 及其 应用 | ||
【主权项】：
一种以体轴向背侧弯曲为标识的高通量逆转斑马鱼Sonic Hedgehog(Shh)信号通路过表达抗肿瘤化合物筛选模型的建立方法，其特征在于，所述步骤包括：(1)Morpholino吗啡琳寡聚核苷酸的合成：Morpholino吗啡琳寡聚核苷酸特异序列具体为5’‑TGCAGTATGTTTGTACCGTCGAGTA‑3’。(2)斑马鱼品系选择：选择野生型AB品系作为实验用鱼。(3)斑马鱼胚胎收集，具体步骤：3.1)斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行，每次交配准备6～10对成年斑马鱼，平均每对能产200～300个胚胎。3.2)收取受精后0.75小时内的斑马鱼胚胎。3.3)在28.5±0.5℃条件下，孵育胚胎。(4)Morpholino寡聚核苷酸的显微注射：4.1)注射前一天，选取30条优质成年斑马鱼进行人工交配，雌雄比例为1:2。4.2)挑出死卵和未受精卵，收集高质量的单细胞受精卵。4.3)制作显微注射针。4.4)配置不同浓度的显微注射液。4.5)制作显微注射盘。4.6)Morpholino寡聚核苷酸的显微注射：选取单细胞期的斑马鱼胚胎进行Morpholino的显微注射，每组注射200枚斑马鱼胚胎，每枚胚胎注射剂量为8ng的Morpholino寡聚核苷酸。(5)胚胎饲养及护理：5.1)在注射后的各实验组斑马鱼胚胎中加入新鲜的胚胎培养液，并放入28.5±0.5℃恒温培养箱中进行培养。5.2)及时挑出培养液中的死胚胎，并定时人工更换斑马鱼胚胎培养液，更换培养液的发育时相点为1.5hpf、6hpf、24hpf。(6)表型初步观察：6.1)在体式显微镜下选取10hpf、24hpf、30hpf的发育时相点进行观察。6.2)出现体轴向背侧弯曲的特异表型时，开始在体式显微镜明视场中统计特异表型。(7)图像获取及统计：7.1)斑马鱼胚胎早期人工破膜。7.2)将破膜之后的胚胎进行麻醉，然后置于甲基纤维素中，在体式荧光显微镜下进行拍照。7.3)随机取20尾斑马鱼在体式显微镜下进行拍照并保存图片。7.4)对表型进行统计，观察体轴向背侧弯曲的特异表型的出现比例及体轴弯曲程度。
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- 张婷婷;董卿 - 山西大学
- 2017-11-10 - 2018-06-22 - C12N15/89
- 本实用新型涉及蝗虫的胚胎显微注射实验装置技术领域，具体涉及一种飞蝗胚胎显微注射预处理装置。本实用新型旨在解决飞蝗胚胎显微注射过程前多次洗涤、胚胎转孔工作量大、耗时长及易损伤卵等问题，同时可避免在该过程中因更换缓冲液而造成的样品浪费。本实用新型飞蝗胚胎显微注射预处理装置，包括柱状筛网和活动设置在柱状筛网上的四角钩，在所述的柱状筛网的柱体上有多个圆形孔洞，在柱状筛网的顶部设有一个延伸到外侧的直径大于柱状筛网直径的边缘，在边缘上对称分布有四个长方孔洞，四角钩与四个长方孔洞活动连接。
- Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用-201810087330.7
- 袁浩;周隽;朱军 - 上海交通大学医学院附属瑞金医院
- 2018-01-30 - 2018-06-01 - C12N15/89
- 本发明公开了一种Cebpa基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用；设计针对斑马鱼cebpa基因的TALEN序列；构建其左右臂质粒，并体外转录出相应的mRNA；将TALEN左右臂mRNA混合并显微注射到斑马鱼受精卵中；注射后的胚胎养至F0成鱼与野生型成鱼交配，将携带有cebpa基因突变的胚胎养至F1成鱼；含有cebpa基因突变的F1成鱼再与野生型成鱼交配，产生的胚胎养至F2成鱼，通过剪鱼尾鳍抽提基因组DNA的方法鉴定，确定所述突变体。本发明通过TALEN基因编辑技术，能够快速高效的建立cebpa基因缺失斑马鱼品系，利用该模型能够开展针对治疗白血病，肝脏发育不良以及粒细胞缺失等疾病的药物筛选工作。
- 一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法-201510071972.4
- 张存芳;赵凯;童超;刘思嘉;汤永涛;冯晨光;张仁意;李国刚 - 中国科学院西北高原生物研究所
- 2015-02-12 - 2018-06-01 - C12N15/89
- 本发明涉及一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式，该模式是指包含EDA基因外显子4位点碱基插入的鳞片缺失斑马鱼。同时，本发明还公开了该模式的建立方法和应用。本发明建立的鳞片缺失斑马鱼模式在皮肤附件相关基因功能研究、筛选治疗人类头发稀少等外胚层发育不良药物等方面具有很大的应用价值。
- 一种脊尾白虾胚胎显微注射方法及利用方法构建mRNA过表达模型-201611006768.5
- 张继泉;宋凤阁;桂天书;相建海 - 中国科学院海洋研究所
- 2016-11-16 - 2018-05-25 - C12N15/89
- 本发明属于基因编辑技术领域，具体说一种脊尾白虾胚胎显微注射方法及利用该方法构建mRNA过表达模型。在高渗透压的显微注射体系及特定的显微注射条件下向脊尾白虾单细胞期胚胎进行显微注射。以体外转录mRNA作为注射材料，采用所述脊尾白虾胚胎显微注射方法，构建过表达mRNA的脊尾白虾模型。利用本发明成功实现了体外转录EGFPmRNA在脊尾白虾胚胎中的表达。脊尾白虾胚胎显微注射方法的建立及其在构建mRNA过表达模型中的应用，对于开展虾类等甲壳动物功能基因的研究及其基因编辑都具有重要理论意义和实践意义。
- 一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法-201510085682.5
- 钟伯雄;叶露鹏;钱秋杰;尤征英;车家倩;张玉玉;宋佳 - 浙江大学
- 2015-02-17 - 2018-04-20 - C12N15/89
- 本发明公开了一种类转录激活子效应蛋白介导的高效转基因方法。采用分子生物学技术构建包含类转录激活子效应蛋白DNA序列和piggyBac转座酶DNA序列的辅助质粒，在体外转录成mRNA；采用显微注射法将该辅助质粒的mRNA与含有外源基因的piggyBac转座子质粒的DNA一起导入到动物的受精卵中，获得外源基因能够稳定遗传和表达的转基因动物；根据标志基因或基因的表达特征筛选出转基因阳性个体；本发明方法可以使piggyBac转座子在TALE‑PBase融合蛋白的作用下高效的插入宿主生物的基因组中，可显著地提高piggyBac转座子介导的转基因效率，为获得转基因动物以及插入诱变等研究提供帮助。
- 严重联合免疫缺陷动物模型的构建以及应用-201610667884.5
- 张海;师长宏;彭思颖;李红伍;张鑫淼 - 北京艾德摩生物技术有限公司;中国人民解放军第四军医大学
- 2016-08-15 - 2018-03-06 - C12N15/89
- 本发明涉及一种严重联合免疫缺陷动物模型的构建以及相关应用，该构建方法通过CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码动物T、B细胞的Rag2基因及参与编码细胞因子受体的Il2rg基因，实现了免疫缺陷程度更高的动物模型的构建。
- 一种外源物质导入鸡胚的方法-201711031012.0
- 李碧春;靳锴;左其生;张亚妮 - 扬州大学
- 2017-10-30 - 2018-02-23 - C12N15/89
- 本发明公开了一种外源物质导入鸡胚的方法，属于生物技术领域，具体包括如下步骤（1）对孵育48‑58h的13‑17 HH早期胚蛋在无菌条件下开口，找到胚胎位置，剥去胚蛋外壳膜，露出胚胎血管；（2）将需要导入的外源物质注入到玻璃注射针中，通过显微注射仪注射到鸡胚血管中；（3）注射后加入青链霉素至注射部位，然后使用医用胶带封口。本发明旨在鸡胚早期（13‑17 HH）通过血管注射导入外源物质，为鸡胚注射的广泛应用奠定基础。本方法适用于鸡胚外源基因或细胞导入，转基因鸡和嵌合体制备，操作简便快速，外源物质导入效率高。
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