[发明专利]构建中小片段RNA测序文库的方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，目的在于提供一种构建中小片段RNA测序文库的方法。本发明主要步骤为：1、小片段cDNA的制备，2、大片段cDNA的制备，3、PCR扩增。本发明将大片段RNA用随机引物法进行文库的制备，克服了接头连接法受限测序读长的问题，又将小片段RNA用类似接头连接法且不需要保证RNA的5’端必须是磷酸基团，进行文库的制备，保留了小片段RNA的信息，使得测序信息更加全面。

主权项

一种构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于：所述的方法如下：样品总RNA经过电泳分离得到小片段RNA和大片段RNA，所述的小片段RNA的分子量M1的大小为50nt≤M1＜150nt，所述的大片段RNA的分子量M2的大小为150nt≤M2≤500nt；一、小片段cDNA的制备（1）用碱性磷酸酶对小片段RNA去磷酸化处理，去除小片段RNA两端的磷酸基团，去磷酸化的小片段RNA经纯化后得到小片段RNA纯化物；（2）用T4 RNA连接酶将RNA接头连接在小片段RNA纯化物的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得分子量80~180nt的RNA连接产物；（3）以步骤（2）得到的RNA连接产物为模板，以与RNA接头互补的DNA为反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA链；（4）用RNase A消化步骤（3）得到的反转录产物，消化后的反转录产物经电泳分离并纯化处理得分子量80~180nt的cDNA片段；（5）用T4 DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤（4）纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量110~210nt的小片段cDNA；二、大片段cDNA的制备A、以大片段RNA为模板，以带有6个随机碱基的接头为反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA；B、用氢氧化钠消化步骤A的反转录产物，消化后的反转录产物进行离心纯化得纯化的cDNA；C、用T4 DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤B得到的纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量150~560nt的大片段cDNA；三、PCR扩增将步骤一得到的最终产物小片段cDNA和步骤二得到的最终产物大片段cDNA在PCR引物以及DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增，然后将小片段cDNA扩增产物和大片段cDNA扩增产物以等摩尔数进行混合，混合产物即为中小片段RNA测序文库。