[发明专利]构建中小片段RNA测序文库的方法

权利要求书

1.一种构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于：所述的方法如下：

样品总RNA经过电泳分离得到小片段RNA和大片段RNA，所述的小片段RNA的分子量M₁的大小为50nt≤M₁＜150nt，所述的大片段RNA的分子量M₂的大小为150nt≤M₂≤500nt；

一、小片段cDNA的制备

（1）用碱性磷酸酶对小片段RNA去磷酸化处理，去除小片段RNA两端的磷酸基团，去磷酸化的小片段RNA经纯化后得到小片段RNA纯化物；

（2）用T4 RNA连接酶将RNA接头连接在小片段RNA纯化物的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得分子量80~180nt的RNA连接产物；

（3）以步骤（2）得到的RNA连接产物为模板，以与RNA接头互补的DNA为反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA链；

（4）用RNase A消化步骤（3）得到的反转录产物，消化后的反转录产物经电泳分离并纯化处理得分子量80~180nt的cDNA片段；

（5）用T4 DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤（4）纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量110~210nt的小片段cDNA；

二、大片段cDNA的制备

A、以大片段RNA为模板，以带有6个随机碱基的接头为反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA；

B、用氢氧化钠消化步骤A的反转录产物，消化后的反转录产物进行离心纯化得纯化的cDNA；

C、用T4 DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤B得到的纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量150~560nt的大片段cDNA；

三、PCR扩增

将步骤一得到的最终产物小片段cDNA和步骤二得到的最终产物大片段cDNA在PCR引物以及DNA聚合酶的作用下分别进行PCR扩增，然后将小片段cDNA扩增产物和大片段cDNA扩增产物以等摩尔数进行混合，混合产物即为中小片段RNA测序文库。

2.根据权利要求1所述的构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于：所述的电泳分离使用的电泳介质为尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶。

3.根据权利要求2所述的构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于：尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶中尿素的浓度为7~8mol/L。

4.根据权利要求2或3所述的构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于：尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶中聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为6~10%。

5.根据权利要求1或2或3所述的构建中小片段RNA测序文库的方法，其特征在于：步骤三中，PCR引物包括PCR前向引物和PCR反向引物。