[发明专利]构建中小片段RNA测序文库的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种构建中小片段RNA测序文库的方法。

背景技术

核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名，简称RNA。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA）, rRNA（核糖体RNA）, mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。

目前小片段RNA测序文库的制备方法，主要有两种：1. 随机引物法，该方法将RNA用随机反转录成cDNA，然后合成双链的DNA，加上接头，从而完成文库的制备。该方法虽然简单，但是在文库制备的过程中，容易将小片段的RNA丢失；2. 接头连接法， 该方法是将在去磷酸化RNA的3’端加上RNA接头，对连接产物的5’端加上磷酸，加上5’端的RNA接头，反转录以及PCR扩增，从而完成文库的制备。该方法操作繁琐，而且必须保证RNA的5’端是磷酸基团，从而方便RNA接头的连接；该方法制备的文库受限于目前测序读长的局限，使得RNA的序列不能完全被测出。

公开号CN101377021A的发明，公开了一种构建cDNA文库的方法，其特点是简单快速而且不需要核酸内切酶。该方法的主要步骤包括：(1)以总RNA(或者MRNA)为模板，利用引物通过反转录合成CDNA第一条链。(2)利用这对引物通过TAQ DNA合成酶催化的PCR合成CDNA第二条链。(3)将步骤(2)得到的PCR产物通过DNA连接酶直接与T-载体连接，然后转化大肠杆菌感受态，得到CDNA文库。但该方法容易将小片段的RNA丢失，导致测序不完整。

发明内容

本发明的目的在于克服随机引物法容易将小片段的RNA丢失以及接头连接法受限测序读长而使得RNA的序列不能完全被测出的问题，提供一种构建中小片段RNA测序文库的方法，本方法将大片段RNA用随机引物法进行文库的制备，克服了接头连接法受限测序读长的问题，又将小片段RNA用类似接头连接法且不需要保证RNA的5’端必须是磷酸基团，进行文库的制备，保留了小片段RNA的信息，使得测序信息更加全面。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种构建中小片段RNA测序文库的方法，所述的方法如下：

样品总RNA经过电泳分离得到小片段RNA和大片段RNA，所述的小片段RNA的分子量M₁的大小为50nt≤M₁＜150nt，所述的大片段RNA的分子量M₂的大小为150nt≤M₂≤500nt；

一、小片段cDNA的制备

（1）用碱性磷酸酶对小片段RNA去磷酸化处理，去除小片段RNA两端的磷酸基团，去磷酸化的小片段RNA经纯化后得到小片段RNA纯化物；

（2）用T4 RNA连接酶将RNA接头连接在小片段RNA纯化物的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得分子量80~180nt的RNA连接产物；

RNA接头的序列如下：

5-p-AGAUCGGAAGAGCGGUUCAGCAGGAAUGCCGAG-NHR-3（SEQ ID NO.1所示）；

（3）以步骤（2）得到的RNA连接产物为模板，以与RNA接头互补的DNA为反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA链；

反转录引物序列如下：

5-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3（SEQ ID NO.2所示）；

（4）用RNase A消化步骤（3）得到的反转录产物，消化后的反转录产物经电泳分离并纯化处理得分子量80~180nt的cDNA片段；

（5）用T4 DNA连接酶将带有突出端的双链DNA接头连接在步骤（4）纯化的cDNA的3’端，连接产物经电泳分离并纯化得到分子量110~210nt的小片段cDNA；