[发明专利]一种定量PCR检测试剂盒及用于检测副溶血性弧菌的方法

摘要

涉及一种荧光定量PCR试剂盒以及用于检测副溶血性弧菌的方法，该试剂盒由PCR反应液管、样本处理液管、阳性对照管、阴性对照管、标准品管、Taq DNA聚合酶管和去离子水管组成，该试剂盒用于副溶血性弧菌的适时、定量检测的步骤是，先采集和处理待测标本再进行加样、分子信标实时定量PCR检测，根据阴性对照和阳性对照的CT值以及检测样本CT值来判断检测样本为阳性还是阴性，然后记录各样本的荧光值和CT值，并从计算机上获取标准曲线，计算各样本中的副溶血性弧菌拷贝数。本发明具有闭管操作，避免假阳性，反应与杂交同步进行，检测时间短的显著效果。

主权项

1.一种定量PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由以下试管组成：(1)PCR反应管：管内反应液由以下体积份组分制成：10×Buffer缓冲液4～6份、25mM MgCl2溶液2～4份、1.25mMdNTP溶液4～8份、序列为5’-TGGCTGACATCCTACATGAC-3’的50μM上游引物0.2～1.0份、序列为5’-TCTTCACCAACAAAGTTAGC-3’的50μM下游引物0.2～1.0份、序列为5’-FAM-CGAGCGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGGCTCG-DABCYL-3’的50μM环形分子信标探针0.2～1.0份、去离子水25～30份；(2)样本处理液管：管内处理液由以下体积份组分制成：0.5mol/LEDTA(PH8.0)8～12份、1％SDS200～300份、20mg/ml蛋白酶K5～8份和蒸馏水200～250份；(3)阳性对照管：管内试剂为以下插入序列的重组阳性质粒DNA：GGTCAATGTA GAGGTCTCTG ACTTTTGGAC AAACCGTAAT GTAAAAAGAA AACCGTACAAAGATGTTTAT GGTCAATCAG TATTCACAAC GTCAGGTACT AAATGGCTGA CATCCTACATGACTGTGAAC ATTAATGATA AAGACTATAC AATGGCAGCG GTGTCTGGCT ATAAGCACGGTCATTCTGCT GTGTTCGTAA AATCAGATCA AGTACAGCTT CAACATTCCT ATGATTCTGT AGCTAACTTT GTTGGTGAAG ATGAAGATTC TATTCCAAGT AAAATGTATT TGGATGAAACTCCAGAATAT TTTGTTAATG TAGAAGCATA TGAGAGTGGT AGTGG(4)阴性对照管：管内试剂为重组阴性质粒DNA；(5)标准品管：管内试剂分别为107、106、105copy/ml的重组阳性质粒DNA各一支；(6)聚合酶管：管内试剂为5U/μl Taq DNA聚合酶管；(7)去离子水管：管内试剂为去离子水；