本发明提供一种高蛋白酶稳定性色氨酸富集抗菌肽及其制备方法和应用,抗菌肽序列如SEQ ID No.1所示。选择Trp和Arg作为疏水和带电核心,并将Arg置于Trp前方,随后利用Pro对Trp和Arg进行保护,得到RPWP的序列结构单元,将该结构单元重复5遍后得到一条抗酶解短肽,将其C端酰胺化。本抗菌肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌菌种有明显的杀菌作用,且溶血活性和细胞毒性较低,抗菌活性高达6.50μM,细胞选择性指数达到39.40。在人工模拟肠胃液和10mg/mL糜蛋白酶溶液仍保持良好的抗菌活性,并显著降低大肠杆菌感染小鼠腹腔内的细菌负载量,在动物体内同样具备优异的抗菌功能。