本发明公开了一种绿色荧光蛋白鲨源纳米抗体、制备方法及其应用。纳米抗体核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑6,氨基酸序列如SEQ ID NO:7‑12;制备是将绿色荧光蛋白免疫条纹斑竹鲨,提取外周血淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA;扩增VNAR片段,并与噬菌粒连接,构建噬菌体抗体文库;从文库中筛选绿色荧光蛋白特异性的纳米抗体序列并重组表达,获得靶向绿色荧光蛋白的鲨源纳米抗体。本发明的纳米抗体来源于条纹斑竹鲨,其分子量小、稳定性强、组织穿透能力强以及可识别隐藏抗原表位,可用于绿色荧光蛋白的亲和纯化、免疫学检测、分子成像、免疫传感探针等领域。