本发明公开了一种用于结直肠癌类器官培养的培养液及其制备方法,属于生物医药技术领域。该培养液由如下原料制成:伊卡倍特钠,维生素P4,人重组蛋白R‑Spond i n 1,头蛋白,人重组蛋白rhEGF,4‑羟乙基哌嗪乙磺酸,L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺,青链双抗,N2添加剂,B27添加剂,N‑乙酰‑L‑半胱氨酸,Al k抑制剂A83‑01,4‑(4‑氟苯基)‑2‑(4‑羟基苯基)‑5‑(4‑吡啶基)‑1H‑咪唑,胃泌素,非必需氨基酸溶液,烟酰胺和Advanced DMEM/F‑12培养基。本发明的培养液能使结直肠癌组织细胞在培养的过程中能够保持非常高的细胞和组织活性,更好地表现其固有的病理特征。