本发明提供了用于检测肺结节良恶性的甲基化标志物及其应用。所述标志物包括序列为Seq ID No:1至Seq ID No:35所示序列或其完全互补序列中至少一个的片段、或所示序列及其上下游1kb序列在内的片段、所示序列的区域中的DNA甲基化位点、与所示序列具有至少90%以上序列同一性且与具有相同甲基化位点的变体或所示序列的区域中所覆盖的DNA甲基化单倍型及所述DNA甲基化单倍型的丰度。本发明基于肺结节良性和恶性样本的甲基化测序数据,筛选到甲基化水平在良性肺结节和恶性肺结节中存在明显差异的标志物,可以用于有效鉴别肺结节的良恶性,并且具有较高的灵敏度和特异性,适用于肺结节的早期鉴别与诊断。