[发明专利]一种提高大豆胞囊线虫侵染效率的抗性鉴定方法

权利要求书

1.一种提高大豆胞囊线虫侵染效率的抗性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）选择受大豆胞囊线虫感染的病土和无菌细沙分别以3∶0.5~1.0的体积比均匀混合，制备成试验病土；将萌发3~5 d，子叶出土期的感病对照大豆Lee植株移栽至装有试验病土的实验杯中，每个实验杯移栽1株，并放入底部垫有4cm高底滤网的塑料筐中培养；

培养条件为：白天16h与黑夜8h轮替；温度：白天27℃±1℃，黑夜24℃±1℃；湿度65-70%；其中白天在塑料筐注入0.3cm-0.5cm高的水，黑夜时保持塑料筐底部干燥；

（2）待大豆Lee植株培养25 d后，将大豆Lee植株从试验病土中倒出，采用淘洗-过筛法从根系中分离大豆胞囊，依次用“25目-60目-100目”筛网，将从根系上冲洗的大豆胞囊搜集至100目筛网上；经过破碎胞囊、蔗糖梯度离心法进行纯化处理后，在显微镜下对大豆胞囊线虫虫卵进行计数，用于后续接种；

（3）将萌发3~5 d的待鉴定材料移栽至无菌土中，每个材料重复4次，3-5d后长出新根，用3×75mm螺丝刀，在紧挨着待鉴定材料根系旁边扎孔，随后借助1mL枪头辅助将步骤（2）所得接种液通过孔洞注入根系附近，接种时分两次进行，每次注入一个孔，一次接种1500个虫卵/株，两次接种间隔24h；

（4）将虫卵接种至待鉴定材料后，在温室培养25天，将待鉴定材料植株从试验病土中倒出，采用淘洗-过筛法从根系中分离胞囊，计数根系上大豆胞囊数目；

（5）根据待鉴定材料平均每株根系上的大豆胞囊数目计算胞囊指数FI，确定抗病等级。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受大豆胞囊线虫感染的病土中，选择大豆胞囊线虫为1号、2号、3号、4号或5号生理小种中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述实验杯的规格为：上口直径×下口直径×高=70mm×50mm×90mm；塑料筐的内部尺寸为：长×宽×高=530mm×341mm×70mm。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化处理的具体步骤为：用橡皮塞破碎大豆胞囊、释放虫卵，虫卵依次通过“100目-200目-500目”的筛网进行筛分，最后将虫卵搜集至500目筛网上，利用洗瓶和漏斗，将虫卵转移至50mL离心管，体积控制在20mL以内，加入20mL质量分数为40%的蔗糖溶液，轻轻颠倒混匀；在2000rpm条件下离心5min；

若出现分层，则取用中间的一层虫卵，弃掉上部上清和底部沉淀，在600目筛网上过滤，清水洗涤去除蔗糖，在洗瓶和漏斗的辅助下将虫卵冲洗至烧杯，稀释后，取10μL在显微镜下计数大豆胞囊线虫虫卵数目，用于后续接种；

若未分层，则吸取上清液中的虫卵，弃掉底部沉淀，并将吸取的上清液在600目筛网上过滤，清水洗涤去除蔗糖，留虫卵在600目筛网上；在洗瓶和漏斗的辅助下将虫卵冲洗至烧杯，稀释后，取10μL在显微镜下计数大豆胞囊线虫虫卵数目，用于后续接种。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，若用于鉴定试验的感病对照Lee单株根系上大豆胞囊数目大于或等于100，则认定此次试验数据有效；若用于鉴定试验的感病对照Lee单株根系上大豆胞囊数目小于100，将重复步骤（1）、（2），利用感病对照Lee再次扩繁该病土中的胞囊数量，直到繁殖出足够用于接种鉴定的虫卵量，再开展抗性鉴定。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胞囊指数FI =待鉴定植株根系上的平均胞囊数目/感病对照Lee植株上的胞囊数目×100。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胞囊指数FI与抗病等级的关系为：FI=0，免疫；0FI≤10，抗病；10FI≤30，中抗；30FI≤60，中感；FI60，感病。