[发明专利]一种雷氏普罗威登斯菌rtxD基因引物及荧光定量PCR检测方法和应用

权利要求书

1.一种不以疾病的诊断和治疗为目的的利用基因引物荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌的方法，其特征在于：步骤如下：

提取待测细菌样品DNA；

以步骤中所提取的DNA为模板，采用荧光定量PCR方法扩增雷氏普罗威登斯菌rtxD基因，其中所使用引物的核苷酸序列为RD-F和RD-R，在58-61℃退火阶段根据荧光信号积累确定Cq值，在扩增条件后增加65℃至95℃，进行融解曲线分析；

雷氏普罗威登斯菌的标准曲线的绘制：根据所选用的重组质粒作为模板，进行荧光定量扩增，绘制标准曲线；

实验结果判定标准：若阴性对照品无Cq值，且无规则扩增曲线，同时Cq值应在15-35之间，扩增曲线规则，判断为阳性，并将所得Cq值在步骤中所得标准曲线上确定样品中雷氏普罗威登斯菌的数量；反之，判断为阴性；

所述步骤的具体步骤为：

以步骤中所提取的DNA为模板，采用荧光定量PCR方法扩增雷氏普罗威登斯菌rtxD基因，体系为Green Premix Ex Taq II 10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，使用DEPC水补足至20 μL；

采用两步法进行荧光定量PCR扩增，PCR反应条件为：95℃ 3 min；95℃ 10 s，58-61℃1 min，40个循环；

72℃ 延伸2 min，在退火阶段根据荧光信号积累确定Cq值，在扩增条件后增加65℃至95℃，进行融解曲线分析；

所述步骤中重组质粒的制备如下：

提取雷氏普罗威登斯菌的总DNA，使用引物序列RD-F和RD-R进行PCR扩增：

PCR扩增反应体系为25 μL：Taq PCR Mix 10 μL；RD-F 1 μL，RD-R 1μL；DNA模板2 μL；用ddH₂O补足到25 μL；

PCR反应条件为：95℃5 min；95℃30 s，58-61℃40 s，72℃1 min 30个循环；72℃再延伸10 min；

回收目的条带并与pM18-T连接、转化、鉴定正确后测序，经测序分析，雷氏普罗威登斯菌rtxD基因序列扩增正确；

将所得含有重组质粒的大肠杆菌在37℃，150 r/min的摇床中培养12-16 h，提取质粒，即可用作荧光定量PCR扩增的模板的重组质粒；

所述步骤中绘制标准曲线的具体步骤如下：

使用重组质粒作为荧光定量PCR扩增的模板，经10倍梯度稀释，得到不同浓度的DNA模板：1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³ 拷贝/反应；

采用荧光定量PCR方法扩增，体系为Green Premix Ex Taq II 10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，使用DEPC水补足至20 μL；

采用两步法进行荧光定量PCR扩增，PCR反应条件为：95℃ 3 min；95℃ 10 s，58-61℃1 min，40个循环；

72℃ 延伸2 min，在退火阶段根据荧光信号积累确定Cq值，在扩增条件后增加65℃至95℃，进行融解曲线分析，每个样本三个平行；

进行荧光定量PCR后得到每个浓度的Cq值，以拷贝数log₁₀值和Cq值制作细菌悬液的标准曲线，E=99.1%，R²=0.999 ；

其中，所述基因引物为不以疾病的诊断和治疗为目的的荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌rtxD基因引物，所述引物的核苷酸序列如下：

RD-F：SEQ NO.1；

RD-R：SEQ NO.2。

2.根据权利要求1所述的不以疾病的诊断和治疗为目的的利用基因引物荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌的方法，其特征在于：所述步骤中荧光定量PCR方法中使用的荧光染料为TB Green II。

3. 根据权利要求1所述的不以疾病的诊断和治疗为目的的利用基因引物荧光定量PCR检测雷氏普罗威登斯菌的方法，其特征在于：所述步骤中重组质粒DNA的浓度为1.0×10³- 1.0×10⁷ 拷贝/反应，绘制标准曲线，E=99.1%，R²=0.999。