[发明专利]蛋白酯酶E8及其表达纯化、晶体结构和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体为来源于深海细菌E4A9^T的的蛋白酯酶E8及其表达纯化、晶体结构和应用。所述酯酶E8有241个氨基酸，分子量为26.28kDa；在表达菌株中高度可溶性表达,可获得高表达量和高酶活的酯酶E8；底物为对硝基苯酚丁酸酯（C4）时催化活性最高，酯酶E8在有机溶剂中仍保持较高活性。酯酶E8的晶体结构分辨率达到1.5Å，该结构由6个β折叠和15个α螺旋组成，其中，第77位丝氨酸，第101位天冬氨酸与第222位组氨酸所构成的催化三连体组成酶学活性中心。该酯酶酶学活性高，成本低廉，可用于食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、废水处理、洗涤工业等领域，E8的三维结构可在工业酶制剂中底物改造及提高酶活方面具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种深海沉积物蛋白酯酶E8、其体外重组表达纯化、晶体结构，及其在工业酶制剂中的应用。

背景技术

酯酶(esterase EC 3.1.1.1)广泛存在于微生物中，能够催化酯类化合物的水解和合成。酯酶具有许多优良的特性，例如具有高度手性选择特异性，催化反应不需要辅酶和辅因子，拥有较广的底物谱，在有机溶液中保持高稳定性等，使得酯酶在工业生产中成为重要的催化剂。酯酶可广泛应用于手性药物合成、食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、废水处理、洗涤工业等领域。

海洋来源的酯酶通常具有与海洋环境相关的优良性质，例如温度稳定性、耐盐性、耐碱性、耐低温、以及优异的手性选择性等等，因此，从海洋微生物中筛选出独具特性的酯酶就成了开发新型工业酶制剂的一个重要方向。本发明利用结晶的方法得到了酯酶E8的蛋白晶体并解析了其三维结构。E8晶体结构可在工业酶制剂中底物改造及提高酶活方面具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于深海细菌E4A9^T的酯酶E8，并对其进行基因工程改造，获得在大肠杆菌中的高效表达、纯化和结晶的方法，以及提供所述酯酶E8第1位到第241位氨基酸的三维晶体结构，及其在工业方面的应用。

本发明提供一种来源于深海细菌E4A9^T的酯酶E8，其有241个氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，分子量为26.28kDa。

本发明还将来源于深海细菌E4A9^T的酯酶E8进行基因工程改造，将其全长基因克隆在pET28b-sumo的载体上。其中，扩增酯酶全基因的上游引物为：

E8F(5’-TCGCGGATCCATGGCTGTTTTTCTTCTG-3’，BamHI)，(SEQ.ID.NO.2)；

下游引物为：

E8R(5’-TCCGCTCGAGTCATCCCACGATCTCCAGC-3’，XhoI)。(SEQ.ID.NO.3)；

表达质粒为pET28b-sumo，转化方法为CaCl₂转化法，转化菌株为大肠杆菌DH5α，表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)plus。

本发明优先选择了使用大肠杆菌的原核细胞表达系统(但不排除其他的表达系统，如在其它细菌或者其他的真核生物细胞中进行表达)；对以上所述蛋白以融合蛋白的方式进行表达，优先选择了His标签得到了可溶性表达(但不排除其它标签，如MBP或GST等标签也有可溶性表达)。

本发明提供来源于深海细菌E4A9^T的酯酶E8的表达和纯化方法，该方法包括：构建融合未突变的E8全长基因的重组载体，用该载体转化大肠杆菌，从而表达带有标签的融合蛋白E8，将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法分离出目的蛋白，去除标签后再通过凝胶过滤层析的方法得到高纯度的E8的蛋白。