[发明专利]一种分离番茄果实原生质体的方法有效
| 申请号： | 201611142226.0 | 申请日： | 2016-12-12 |
| 公开（公告）号： | CN106701658B | 公开（公告）日： | 2019-09-06 |
| 发明（设计）人： | 田世平;陈彤;秦国政;徐勇 | 申请（专利权）人： | 中国科学院植物研究所 |
| 主分类号： | C12N5/04 | 分类号： | C12N5/04 |
| 代理公司： | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人： | 关畅;白艳 |
| 地址： | 100093 北京市海淀*** | 国省代码： | 北京;11 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 原生质体 番茄果实 分离番茄 酶解 果实发育 果实组织 纤维素酶 果实 酶液 基因表达模式 原生质体得率 亚细胞定位 表达模式 酶解处理 相关基因 用量减少 重要工具 果胶酶 离析酶 孵育 蛋白 消化 研究 应用 | ||
1.一种分离番茄果实原生质体的方法，包括如下步骤：
1）用酶液酶解番茄果实，收集酶解后果实组织；
2）将所述酶解后果实组织在PME溶液中孵育，即得到番茄果实原生质体，实现番茄果实原生质体的分离；
所述PME溶液由300-500 mM甘露醇、40-60 mM PIPES、10-30 mM MgCl2、10-30 mM EDTA和水组成；
所述酶液为由纤维素酶、果胶酶、离析酶和GKMMB溶液组成，
所述纤维素酶在所述酶液中的质量百分比为0.5-1%，所述果胶酶在所述酶液中的质量百分比为0.3-0.5%、所述离析酶在所述酶液中的质量百分比为0.3-0.5%；
或，所述GKMMB溶液由终浓度为300-500 mM甘露醇、10-30 mM KCl、40-60 mMMgSO47H2O、1-3 mM MgCl2、50-150 mM MES、质量百分含量为1-3% BSA和水组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述PME溶液由400 mM甘露醇、50 mM PIPES、20 mM MgCl2、10 mM EDTA和水组成；
或，所述PME溶液由400 mM甘露醇、40 mM PIPES、10 mM MgCl2、10mM EDTA和水组成；
或，所述PME溶液的pH为6-8；
或所述纤维素酶在所述酶液中的质量百分比为1%，所述果胶酶在所述酶液中的质量百分比为0.4%、所述离析酶在所述酶液中的质量百分比为0.5%；
或，所述纤维素酶在所述酶液中的质量百分比为1%，所述果胶酶在所述酶液中的质量百分比为0.5%、所述离析酶在所述酶液中的质量百分比为0.4%；
或，所述GKMMB溶液由终浓度为400 mM甘露醇、20 mMKCl、60 mM MgSO4 7H2O、2 mMMgCl2、50 mM MES、质量百分含量为1% BSA和水组成；
或，所述GKMMB溶液由终浓度为400 mM甘露醇、20 mMKCl、50 mM MgSO4 7H2O、2 mMMgCl2、50 mM MES、质量百分含量为1% BSA和水组成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述孵育的方式为22-30℃、60 rpm震荡2-5小时。
4.根据权利要求1或2 所述的方法，其特征在于：所述酶解的温度为22-30℃，所述酶解的方式为先0.07-0.08 MPa保持5分钟，再在黑暗常压状态下于60 rpm震荡3小时55分，再在黑暗常压状态下于80 rpm震荡5分钟。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
在所述孵育后，还包括如下步骤:先将孵育后的体系中的果实组织去除，得到细胞孵育液；再将所述细胞孵育液过滤，收集过滤液；再将所述过滤液离心，收集沉淀，得到果实原生质体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述过滤采用的孔径为100-300μm的细胞筛；
或，所述离心的条件为22-25℃，150-180 g，3-5min。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述番茄果实为0.1-1 mm厚番茄果实切片。
8.一种分离番茄果实原生质体的试剂盒，包括权利要求1或2所述PME溶液；
所述试剂盒还包括权利要求1或2所述酶液。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于中国科学院植物研究所，未经中国科学院植物研究所许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201611142226.0/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
