[发明专利]一种增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程药物技术领域，特别涉及将野生型TRAIL蛋白编码cDNA序列与一内源性凋亡抑制剂分子XIAP的拮抗蛋白SMAC的N端7肽编码cDNA通过一特定的细胞内源性蛋白酶剪切位点AP编码cDNA序列连接，在融合基因前面再加上高效穿膜肽序列，构建成R8+SMAC N7+AP+TRAIL（114-281aa）或TAT+SMAC N7+AP+TRAIL（114-281aa）融合基因序列，采用经pTWIN1改造的大肠杆菌表达载体表达上述融合蛋白，分离纯化上述融合蛋白得到能增强TRAIL抗肿瘤活性的双靶点融合蛋白。 

背景技术

1.TRAIL蛋白结构及分子生物学 

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand；TRAIL）为肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）超家族的成员，其基因序列分别于1995年由Wiley等人（Wiley et al.1995）和1996年由Pitti等人（Pitti et al.1996）独立克隆获得。后者将其命名为凋亡素2配体（Apo2ligand，Apo2L），后来的研究证实Apo2L与TRAIL实为同一种蛋白，因此习惯上可将其称为Apo2L/TRAIL。 

人Apo2L/TRAIL的编码基因定位于染色体3q26（Miriani and Krammer.1998），完整的Apo2L/TRAIL的cDNA序列编码全长为281个氨基酸的前体蛋白，其相对分子质量为32.5kDa。天然的Apo2L/TRAIL蛋白表现为Ⅱ型跨膜蛋白，分细胞外C端区域、跨膜区、细胞内N端区域等三部分。Apo2L/TRAIL的N端1-14aa为短小的胞内段，无信号肽序列；第15-40位aa为疏水区，形成跨膜结构；C端第41-281位aa为胞外区，保守性强。C端能形成几个β折叠，再形成典型的β夹心结构，进而形成同源三聚体的亚单位，胞外区为蛋白发挥功能的主要结构区。Apo2L/TRAIL前体蛋白在特定的蛋白酶作用下水解形成可溶性TRAIL，其第114-281aa为蛋白质的可溶性片段（Miriani and Krammer.1998）。 

人Apo2L/TRAIL的C端（胞外区）序列与TNF和Fas配体一样高度保守，人TRAIL分子的胞外区与Fas配体、肿瘤坏死因子α、淋巴毒素-α和淋巴毒素-β的同源性分别为28%、23%和22%（Wiley et al.1995）。TRAIL与TNF家族其他成员最独特的区别在于其第137-152位形成一个12-16个aa的插入环（AA’loop），此结构可插入受体的TRAIL结合位点，保证受体与TRAIL的特异性结合。结构突变研究证实，此插入环在TRAIL细胞毒性中起着关键的作用。晶体结构研究表明，Apo2L/TRAIL分子为一个同源三聚体分子，内部含有一个Zn原子，Zn原子同时与三个配体亚单位的第230位半胱氨酸连接，通过相互作用以维持分子的稳定（Hymowitz，et al.2000）。TRAIL是TNF家族中唯一的具有一个Cys残基的成员，Zn原 子的结合对于同源三聚体的稳定性和生物活性至关重要（Bodmer et al.2000；Hymowitz，et al.2000）。Jean等研究证实，如将第230位半胱氨酸（Cys）突变为丝氨酸或丙氨酸后，TRAIL将形成无活性的二聚体结构，与受体的亲和力将下降200倍，严重影响TRAIL诱导细胞凋亡的活性（Jean et al.2000）。 

TRAIL的功能首先是作为生物体先天性或获得性免疫的调节剂，其次在细胞外源性凋亡途径过程中发挥重要作用，作为免疫监视在抗肿瘤过程中发挥重要作用。TRAIL的最大优点是可以选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞几乎没有毒性。研究资料表明，Apo2L/TRAIL无论在体内，还是体外对于各种来源的人肿瘤细胞系，包括结（直）肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、中枢神经系统肿瘤、甲状腺癌、淋巴瘤、白血病以及多发性骨髓瘤等都具有诱导凋亡的作用（Ashkenazi et al.1999；Ashkenazi2002）。 

从TRAIL发现至今近20年时间里，TRAIL一直被作为一个重要的潜在抗肿瘤药物开发，TRAIL的临床试验在国外已进入Ⅱ期，在国内已完成Ⅲ期。大量体内外试验均证实，TRAIL具有肿瘤特异性细胞毒性，尤其当它与小剂量化疗药物联用时即表现出明显的协同和增效作用。相反，研究发现机体中凋亡机制的缺失导致的TRAIL耐受与肿瘤细胞的快速生长和转移明确相关。