[发明专利]一种一菌多酶菌株产蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种一菌多酶菌株产蛋白酶的方法，具体涉及对一菌多酶菌株产蛋白酶的条件进行优化，并对蛋白酶酶学性质进行分析，属于微生物技术领域。 

背景技术

酶制剂最初是以动、植物作为原料直接提取，但由于动、植物生长周期长、原料有限、酶提取工艺复杂等多种因素的影响，不适于大规模的工业生产。而微生物在酶制剂的生产中有其他生物不可比拟的优越性：微生物对外界环境有很强的适应性和变异能力，人们可利用各种生物学技术按照自己的意愿对微生物进行改造，生产出目的酶；微生物对营养物质的要求不高，大部分是农产品废弃物，价格低廉，易得到，生产成本低；大部分微生物繁殖快，生长周期短，有利于提高酶制剂的产量等。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种一菌多酶菌株产蛋白酶的方法。 

为了实现上述目的，本发明的方法采用了一种一菌多酶菌株产蛋白酶的方法包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1.1111，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 2011286，可产蛋白酶等9种酶，其中蛋白酶活特别高，将其刺种在酪蛋白琼脂培养基上，在37℃温箱中培养24h，发现有水解圈产生，而且水解圈与菌落直径的可达4.80。 

在培养基初始pH值7.0，接种量为3％，种龄22h，培养温度37℃，发酵时间24h时，所产生的蛋白酶酶活达到最高。 

以1％可溶性淀粉为最佳碳源、1％酵母浸粉为最佳氮源，使发酵培养基组分达到最优。 

所产生的蛋白酶在温度25-40℃范围内稳定性较好。 

所产生的蛋白酶最适作用温度为40℃。 

所产生的蛋白酶在pH5.5-6.5条件下较稳定。 

所产生的蛋白酶在最适pH为值5.7。 

在所产生的蛋白酶，Mn²⁺和Cu²⁺可显著提高该蛋白酶的酶活，Mg²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺对该蛋白酶也有一定的促进作用，Al³⁺、Fe²⁺对该蛋白酶具有不同程度的抑制作用，且Al³⁺的抑制作用明显强于Fe²⁺。 

本发明对影响枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵条件如pH值、接种量、装液量、种龄、培养温度、培养基组分中的碳源、氮源进行优化。结果表明，该菌株产蛋白酶的最适发酵时间24h，最适宜培养基pH值7.0，接种量为3％，装液量15mL/100mL，种龄22h，控制培养温度37℃。最优碳源为可溶性淀粉，氮源为酵母浸粉。并通过Folin酚法对影响蛋白酶酶活的温度、pH、热稳定性以及金属离子等因素进行了研究。结果表明该菌株所产蛋白酶最适作用温度为40℃，最适作用pH为5.7，Mn²⁺和Cu²⁺对酶有一定的促进作用，Al³⁺对酶有强烈的抑制作用。本发明中所涉及的枯草芽孢杆菌菌株可产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等9种酶，其中蛋白酶、甘露葡聚糖酶和糖化酶产量比较高，而各酶之间的相互影响因素、诱导条件，最佳产酶条件及复合酶制剂最佳配伍都有待于进一步开发研究。本发明对蛋白酶最适的培养基配制、最适的发酵条件以及影响其酶活的相关因素进行了探讨，以期达到高质、高量的产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等复合酶制剂，实现一菌多酶发酵奠定了基础。 

酪氨酸标准曲线的绘制 

取6支试管，依照表1配制不同浓度的酪氨酸标准溶液，分别取上述溶液各1.00mL，各加0.4mol/L碳酸钠溶掖5.00mL，Folin酚试剂稀释液1.00mL，置于40℃±2℃水浴中显色20min后取出，用分光光度计于波长660nm，用10mm比色皿比色，以不含酪氨酸的0号管为空白，分别测定其吸光度，记录OD660值。以吸光度为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据作图，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量，即为吸光常数K值。 

表1酪氨酸标准曲线绘制方法 

酶活的计算公式：蛋白酶活力(U/mL)＝ΔOD660nm×N×K×4/10 

ΔOD660nm为以对照样品为空白时样品的光密度值； 

K为光密度为1.00时所相当的酪氨酸浓度； 

N为酶液的稀释倍数； 

4为反应试剂的总体积； 

10为反应时间10min。