[发明专利]α-氨基酸酯水解酶突变体

说明书

 技术领域：

 本发明与多肽有关，尤其与来源于大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-aeh的a-氨基酸酯水解酶突变体有关。

背景技术：

α-氨基酸酯水解酶（EC 3.1.1.43）相比青霉素酰化酶而言，具有诸多优点：不受苯甘氨酸的抑制；对D型苯甘氨酸甲酯有构象选择性，工业上可以直接使用消旋混合物，而不必先进行拆分；其最适反应pH比青霉素酰化酶低，也使反应体系中的底物和产物更稳定。长期以来，a-氨基酸酯水解酶的研究受到生物学家和药学家的重视，有关a-氨基酸酯水解酶产酶菌株的分离、酶基因的鉴定及其在生物转化中的应用也有一些报道。虽然a-氨基酸酯水解酶具有一系列优点，但酶的某些性质还需进一步优化以适应工业化的需要。对于一种具有经济吸引力的酶法制备β-内酰胺抗生素工艺来说，理想的是合成/水解比率（S/H比率）要高。优选地，S/H比率高，且同时酶活性也足够高。

发明内容：

本发明的目的是提供一种用于β-内酰胺抗生素的合成，生产效率高，不对β-内酰胺环有明显水解作用，合成/水解比率高，酶活性也适于合成生产过程的α-氨基酸酯水解酶突变体。

本发明是这样实现的： 

本发明1、α-氨基酸酯水解酶突变体，其特征在于大肠杆菌的a-氨基酸酯水解酶脱氧核糖核酸的碱基序列见序列表中序列1，所编码的多肽的氨基酸序列见序列表中序列2，所述氨基酸序列中的175位上的氨基酸为丙氨酸，所述大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aehY175A的分类命名：大肠埃希氏菌，拉丁文名Escherichia coli，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No.4758。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

应用于β—内酰胺抗生素的合成，合成水解比率为1.9。 

其制备方法如下： 

（1）从大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-aeh中提取图1所示重组质粒pET28a-aeh，大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aeh的分类命名：大肠埃希氏菌，拉丁文名：Escherichia coli，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No.4757,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aeh的制备方法如下： 

a将黄单孢菌基因组用PCR方法扩增目的基因aeh，所用载体为pGEM-T，aeh的酶切位点为EcoRI和XhoI，将EcoRI-aeh-XhoI片段与载体pGEM-T连接，转化入宿主菌JM109，选择白色菌落，得重组质粒pGEM-T-aeh，

b将重组质粒pGEM-T-aeh和载体pET28a双酶切，对线性化后的pET28a载体进行去磷酸化，用连接酶将aeh和载体pET28a连接，转化入宿主菌JM109，得重组质粒pET28a-aeh，

c从宿主菌JM109中提取重组质粒pET28a-aeh转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，

d培养转化细胞，使重组质粒pET28a-aeh随大肠杆菌BL21（DE3）细胞一起大量扩增，

e从扩增的细胞中筛选出含有重组质粒的pET28a-aeh细胞，即得大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aeh。

（2）设计1种定点突变引物，其核苷酸序列如下： 

正向引物：GCATGATCGGTTCGTCCGCCGAGGGCTTCACCG

反向引物：CGGTGAAGCCCTCAGCGGACGAACCGATCATGC