[发明专利]α-氨基酸酯水解酶突变体

权利要求书

1.α-氨基酸酯水解酶突变体，其特征在于大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aehY175A的α-氨基酸酯水解酶脱氧核糖核酸的碱基序列见序列表中序列1，所编码的多肽的氨基酸序列见序列表中序列2，所述氨基酸序列中的175位上的氨基酸为丙氨酸，所述大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aeh Y175A的拉丁文名Escherichia coli，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No.4758。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于应用于β-内酰胺抗生素的合成。

3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于其制备方法如下：

（1）从大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aeh中提取图1所示重组质粒pET28a-aeh，大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aeh的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No.4757,

大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aeh的制备方法如下：

a将黄单孢菌基因组用PCR方法扩增目的基因aeh，所用载体为pGEM-T，aeh的酶切位点为EcoRI和XhoI，将EcoRI-aeh-XhoI片段与载体pGEM-T连接，转化入宿主菌JM109，选择白色菌落，得重组质粒pGEM-T-aeh，

b将重组质粒pGEM-T-aeh和载体pET28a双酶切，对线性化后的pET28a载体进行去磷酸化，用连接酶将aeh和载体pET28a连接，转化入宿主菌JM109，得重组质粒pET28a-aeh，

c从宿主菌JM109中提取重组质粒pET28a-aeh转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，

d培养转化细胞，使重组质粒pET28a-aeh随大肠杆菌BL21（DE3）细胞一起大量扩增，

e从扩增的细胞中筛选出含有重组质粒的pET28a-aeh细胞，即得大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aeh，

（2）设计1种定点突变引物，其核苷酸序列如下：

正向5’GCATGATCGGTTCGTCCGCCGAGGGCTTCACCG3’

反向5’CGGTGAAGCCCTCAGCGGACGAACCGATCATGC3’，

（3）在PCR仪中热循环扩增质粒DNA，

热循环仪中发生以下步骤：

1.94℃        2分钟

2.94℃        30秒

3.58℃        30秒

4.68℃        7.4分钟

5.2-4步       ×15次

72℃        10分钟，

（4）用限制性内切酶切割PCR仪产物，除去野生型质粒，过程如下：向50ulPCR产物中加入2ul 10U/ul的DpnI，混匀，37℃孵育1h去除野生型质粒，

（5）用（4）得到的反应混合物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），

（6）将（5）的培养物制备无细胞裂解液，

（7）将无细胞裂解液用亲和柱纯化，即得突变体。