[发明专利]GeXP多重基因表达遗传分析系统在9种脑炎相关病毒检测中的应用无效
| 申请号： | 201110242055.X | 申请日： | 2011-08-23 |
| 公开（公告）号： | CN102952893A | 公开（公告）日： | 2013-03-06 |
| 发明（设计）人： | 马学军;何玢;梁国栋;王环宇;秦萌 | 申请（专利权）人： | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 102206 北京市昌*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | gexp 多重 基因 表达 遗传 分析 系统 脑炎 相关 病毒 检测 中的 应用 | ||
【说明书】：
发明领域
本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，哨点医院等用于脑炎相关疾病患者血液及脑脊液标本的9种脑炎相关病毒(包括版纳病毒，GI乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna病毒，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒，及云南环状病毒)感染的同时检测和分型。具体在NCBI下载9种脑炎病毒代表株的核苷酸序列，通过查阅文献和多序列比对，确定病原体相对保守区，设计多重特异性引物。进行单管多重(13重)PCR检测9种脑炎病毒保守区，整个反应不到2个小时。本专利克服了病毒培养法、直接荧光抗体法、芯片检测方法的操作繁琐，时间较长，成本较高等缺点，为脑炎病毒分型技术提供了新的思路，其高特异性、高灵敏度、快速的特点为脑炎相关病毒的快速准确筛查和分型提供了有力的技术支撑，对研究我国脑炎症候群的病原谱和分子流行病学调查有重要意义。
发明背景
病毒性脑炎(virus encephalitis)是指由各种病毒感染所引起的脑实质炎症。其主要临床表现为：发热、头痛、意识障碍、抽搐和脑膜刺激症状等。目前报道全世界约有100余种病毒可以引起中枢神经系统感染。其中虫媒病毒包括乙型脑炎病毒(JEV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)及科萨努尔森林热病毒(KFDV)、西尼罗病毒(WNV)等；非虫媒病毒包括单纯疱疹病毒1型(HSV1)和2型(HSV2)、肠道病毒的柯萨奇病毒(COXV)、肠道病毒71型(EV-71)、风疹病毒，和其它病毒如朊病毒、登革热病毒等。
目前病毒性脑炎的实验室诊断主要依靠病毒分离培养、血清学检测和分子生物学方法。病毒分离培养是诊断病毒性脑炎的金标准，但由于脑组织标本难收集，脑脊液中病毒含量低，因此阳性率很低，且耗时耗力。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病毒特异抗体是目前较常用的方法，其操作简单，敏感性和特异性高，但由于缺乏理想的诊断试剂因此只能对十余种病毒性脑炎做出实验室诊断。近几年，以PCR技术为基础的各种分子生物学诊断方法得到广泛应用和发展，其中包括SYBR Green I实时PCR及TaqMan PCR等，但基本都是用于单种病毒检测(如乙型脑炎病毒)而难以对未知病原感染病例做出准确诊断。本研究基于GeXP多基因遗传表达分析系统及多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)建立了一种多重检测方法，同时检测国内常见能引起病毒性脑炎的九种虫媒病毒：版纳病毒，GI乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna病毒，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒，及云南环状病毒。
发明内容
1.在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)下载上述9种脑炎相关病毒代表株的核苷酸序列，通过查阅文献和多序列比对，确定病原体相对保守区，输入GeXP eXpress Profiler软件设计多重特异性引物(Specific-Primer，SP-Primer)。将设计的引物通过NCBI Primer-Blast，Primer Premier5.0分析评价，使各引物具有相对一致的Tm值。在全部正向引物和反向引物的5’端分别加入一段非同源性序列作为通用引物(Tag)，构成特异性嵌合引物。上游通用引物标签的5’端标记荧光染料Cy5(Cy5-Tag-F)。在整个引物体系中加入一对扩增人类RNase P基因的引物Rnasep(F/R)，以检验人源样品质量。引物信息见表1。
2.建立了如下的检测过程，详见如下：
(1)合成引物：引物均由上海Invitrogen公司合成，除Cy5-Tag-F采用HPLC纯化外，其余引物均PAGE纯化。
(2)使用QIAamp Viral RNAMini Kit提取病毒RNA，洗脱体积为30μl，分装置于-80℃保存。
(3)建立同时检测9种脑炎相关病毒的多重RT-PCR反应体系，并对其特异性和灵敏度进行验证。
(4)用该13重RT-PCR检验临床标本，对体系进行验证评估。
表1GeXP 13重RT-PCR检测9种脑炎相关病毒引物信息表
兼并碱基代码：M＝A/C R＝A/G W＝A/T S＝G/C Y＝C/T K＝G/T V＝A/G/C H＝A/C/T D＝A/G/T B＝G/C/T
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- 张玉宝;王亚军;谢忠奎;王若愚;郭志鸿;杨果;邱阳 - 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所;徐州沐阳生物科技发展有限公司
- 2016-04-07 - 2019-10-25 - C12Q1/70
- 本发明提供了一种免疫捕获三重RT‑PCR同步检测百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的方法，其步骤包括在同一个PCR反应管中用LSV、LMoV和CMV的多克隆抗体特异性捕获LSV、LMoV和CMV粒子、利用LSV、LMoV和CMV的特异性引物进行三重反转录聚合酶链式反应RT‑PCR、琼脂糖凝胶电泳检测目的片段；该方法将ELISA和RT‑PCR结合，对现有的免疫捕获RT‑PCR进行了改进，实现了用免疫捕获RT‑PCR同步检测三种百合病毒LSV、LMoV和CMV，从而完善了免疫捕获RT‑PCR技术。
- 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法及应用-201910191679.X
- 刘万里;邓敏;邢珊 - 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）
- 2019-03-14 - 2019-10-25 - C12Q1/70
- 本发明提供一种基于CRISPR‑Cas12a和G四链体‑血红素的HBV的检测方法及应用，过程如下：以HBV患者血清中提取到的DNA为模板，将含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH2O的RPA反应体系加入冻干酶粉中，再加入MgAc混匀，孵育，得到RPA产物；PS2.M DNA溶解在Tris‑HCL溶液，向溶液中加入Hemin溶液，制得PS2.M/Hemin溶液；将FnCas12a和HBV crRNA加入到Tris‑HCl缓冲液中，孵育，制得Cas12a/crRNA复合物溶液；将RPA产物、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/crRNA复合物溶液孵育，加入ABTS和H2O2处理后测定吸光度。本发明是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性和设备简单的检测方法。
- 一种用于检测黄瓜花叶病毒西番莲分离物的引物及其应用-201910525050.4
- 严佳文;解璞;袁启凤;马玉华;王立娟;陈楠 - 贵州省果树科学研究所
- 2019-06-18 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明提供了一种用于检测黄瓜花叶病毒西番莲分离物的引物，所述引物中一对是鉴定黄瓜花叶病毒西番莲分离物的引物CMV‑657F和CMV‑657R，另一对是用于黄瓜花叶病毒西番莲分离物的实时荧光定量RT‑PCR的引物CMV‑174F和CMV‑174R，还提供了应用，用于黄瓜花叶病毒西番莲分离物的定量检测。本发明结合两对引物的定量检测方法灵敏度高、特异性强、检测结果准确，用于西番莲脱毒苗和田间感病植株的早期鉴定和病毒含量定量分析，为西番莲无病毒良种苗木繁育及推广提供技术支撑。该方法能够在4～5小时对样品中的黄瓜花叶病毒西番莲分离物进行准确定量，不仅节约了时间、简化了实验步骤，还有利于在植物发病之前采取相应的补救措施，防止该病毒在作物间广泛传播所带来的巨大经济损失。
- SVA、FMDV、SVDV和VSV的一步法多重实时荧光定量PCR检测引物和探针-201910672178.3
- 王秀明;陈君彦;王玉雯;武瑾贤;魏学峰;刘国英;关平原;范秀丽;张贵刚;王艳杰;刘建奇 - 金宇保灵生物药品有限公司
- 2019-07-24 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种SVA、FMDV、SVDV和VSV的一步法多重实时荧光定量PCR检测引物和探针，属于生物技术检测领域。并基于提供的引物和探针开发出了用于同时检测SVA、FMDV、SVDV和VSV的试剂盒。本发明提供的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好，可以实现对SVA、FMDV、SVDV和VSV同时准确定性和定量检测，将在SVA、FMDV、SVDV和VSV的检测及疫苗生产、例如疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗中发挥重要作用，应用前景广阔。
- 用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用-201910677694.5
- 卢孟孟;胖铁良;王文轩;马蒙蒙;孙晋华;李建中 - 廊坊诺道中科医学检验实验室有限公司
- 2019-07-25 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种用于检测呼吸道病毒的引物探针组合，包括16对引物及对应的16条探针。本发明还提供了用于检测呼吸道病毒的试剂盒，包括用于检测呼吸道病毒的引物探针组合。本发明还提供了用于检测呼吸道病毒的试剂盒在检测或辅助检测呼吸道病毒中的非诊断目的的应用。应用本发明提供的用于检测呼吸道病毒的试剂盒能同时检测16种呼吸道病毒，实现多重检测，灵敏度高，快捷方便，可实现对样本进行批量检测。
- 新型鹅星状病毒SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂盒-201910700274.4
- 李宁;刘思当;蔡玉梅;杨玉栋;姜胜男;赵君 - 山东农业大学
- 2019-07-31 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种新型鹅星状病毒荧光定量PCR检测试剂盒。所述荧光定量PCR检测试剂盒中含有SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示的引物对，以及标准品质粒和荧光定量PCR反应试剂。本发明的荧光定量PCR试剂盒可以对新型鹅星状病毒进行检测，该试剂盒的特异性强，只与新型鹅星状病毒特异性结合，与其他鹅源病毒都没有交叉反应；而且检测的灵敏度高，在标准品为1×101‑1×107拷贝范围内都有极好的线性关系，可以高效检测新型鹅星状病毒病鹅组织以及无临床症状的病毒携带鹅，提高了检测效率。
- 非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒-201910773232.3
- 赵林萍;娄亚坤;杨楠;付燕峰;梁小红;任宝红;崔兴涛;曾小宇 - 郑州中道生物技术有限公司;河南中标检测服务有限公司;郑州大学
- 2019-08-21 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒，包括特异性引物ASFV‑F和ASFV‑R，以及RAA‑exo探针ASFV‑P，用四氢呋喃(THF残基)，dT‑荧光团和dT‑淬灭团取代靶标扩增子序列内的碱基，标记的报告荧光染料为FAM，荧光淬灭基团为BHQ‑1，试剂中的核酸外切酶可在THF位点裂解探针，从而分离荧光基团和淬灭基团并产生荧光信号。本发明提供的试剂盒可在37～42℃恒温条件下，20min内实现非洲猪瘟病毒的检测，特异性为100％，检测敏感性为10copies/μl。因此，本发明的试剂盒具有操作简单、快速、灵敏的特点，为非洲猪瘟病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段。
- 专利分类
- 鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒及其引物组
- 一种用于儿童急性淋巴细胞白血病基因分型的试剂盒
- 同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其四种不同NA亚型的GeXP快速检测试剂盒
- 同时鉴别H5N1和H9N2亚型禽流感病毒的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用
- 同时鉴别8种感染人不同亚型禽流感病毒HA基因的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用
- 同时鉴别禽流感主要流行亚型的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用
- 一种同时鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的引物组合及GeXP检测方法
- 一种同时鉴别3种牛腹泻病病原体的引物组合及GeXP检测方法
- GeXP多重PCR鉴别鹿种的组合物、试剂盒和方法
- 公共引物介导的多重定量PCR检测技术在转基因大豆检测中的应用
