[发明专利]人源胰凝乳蛋白酶的表达及纯化

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，具体涉及一种人源胰凝乳蛋白酶的分离纯化方法，其包括以下步骤：(a)采用含有细胞质二硫化物还原系统两个突变的大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)；(b)促进二硫键形成的载体pET-32a，得到trx标签融合的重组人源胰凝乳蛋白酶原蛋白和(c)使用胰蛋白酶激活重组的酶原，并且在激活酶原的同时将trx标签去除。

该发明在酶原激活的同时完成了增溶标签的去除，避免了昂贵的肠激酶的使用，同时可获得几乎不含多余氨基酸的重组蛋白。生产成本的降低无疑给该工作带来了广阔的工业应用前景。本发明纯化所得的胰凝乳蛋白酶表达量高，纯度好，成本低，可以有效地用于治疗及化学领域。

相关背景

胰凝乳蛋白酶最初被发现存在于牛的胰脏中，目前已从牛的胰脏中纯化出两种无活性的酶原蛋白——胰凝乳蛋白酶原A和胰凝乳蛋白酶原B；之后从猪的胰脏中又纯化出另一种酶原，胰凝乳蛋白酶原C[1]。胰凝乳蛋白酶原A可通过不同的活化方式产生多种形式的有活性的酶(如α、β、γ、π、δ等)，其中α为主要形式；而胰凝乳蛋白酶原B使用大量胰酶激活后即产生最终的活性形式胰凝乳蛋白酶B_π[2]。胰凝乳蛋白酶原A和B具有相似的沉降及扩散常数，并且具有相同的分子量。胰凝乳蛋白酶α在溶液中具有单体和二聚体两种分子形式，胰凝乳蛋白酶B虽然在大多数pH也显示相似的行为，但在pH 4时它们只是以单体形式存在[3]。胰凝乳蛋白酶A和B虽然具有相同的分子量，但是二者具有不同的电泳迁移率。此外二者在离子交换树脂的滞留率不同，且它们对天然的胰蛋白酶抑制剂的敏感性也不同。故可通过准备方法、溶解度、电泳迁移率和等电点将二者区分。一些底物特异性研究结果显示，胰凝乳蛋白酶B水解酰基色氨酸酯的速率要比水解酪氨酰酯和苯丙胺酰酯的速率慢得多。

目前定义胰凝乳蛋白酶A及胰凝乳蛋白酶B的依据就是将不同种属蛋白的氨基酸序列分别与牛的A型或B型进行全序列比对。人源胰凝乳蛋白酶与牛胰凝乳蛋白酶A和B的氨基酸序列同源性分别为82％和86％。按此规则，人源胰凝乳蛋白酶被命名为胰凝乳蛋白酶B。同理，大鼠的胰凝乳蛋白酶也属于胰凝乳蛋白酶B(图1、表1)。然而根据Hudaky等人的研究发现，牛胰凝乳蛋白酶B水解色氨酰酯的速率比水解苯丙胺酰或酪氨酰酯底物的速率慢了两个数量级，而胰凝乳蛋白酶A水解三者具有相似的速率，这是由于Ala226空间位阻大于Gly226空间位阻造成的。因此如果按照酶反应的底物特异性规律来分类，则大鼠的胰凝乳蛋白酶仍属于B型，而人的胰凝乳蛋白酶则属于A型[4]。为了避免不同命名方法带来的混淆，克服酶与底物间特异性差异对实验可能造成的影响，进行人源胰凝乳蛋白酶的表达纯化工作是非常必要的。

此外，人源胰凝乳蛋白酶还具有一定的药用价值。β-chymotrypsin已被临床用于化痰及抗炎症药物(oral mucolytic and anti-inflammatory agent)[5-9]，目前口腔复合酶治疗主要采用Wobenzym N和WobeMugos的方法，成分包括丝氨酸蛋白酶(胰酶、胰凝乳蛋白酶)以及植物金属蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶)。除此之外，胰凝乳蛋白酶还可以针剂或喷剂的形式用于创伤或手术后伤口愈合、抗炎及防止局部水肿、积血、扭伤血肿、乳房手术后浮肿、中耳炎及鼻炎等，而且可用于白内障摘除。目前为止，使用的胰凝乳蛋白酶全部来自动物胰脏，因此该药物的生产受限于可获得的牛或猪的来源。更为重要地是，部分病人在使用异种(性)胰凝乳蛋白酶后会发生过敏反应，严重的甚至会危及生命。而使用基因工程表达人源胰凝乳蛋白酶可以获得不受限制的重组蛋白，从而满足治疗需要[10]。

表1.各种属胰凝乳蛋白酶与牛胰凝乳蛋白酶A和B的序列相似性比较。

              等电点(PI)      与Bovine A的    与Bovine B的

                              同源度          同源度

Bovine A      8.26            100             79.18

Bovine B      4.76            79.18           100

Human B     7.19        81.63        86.12

Rat B       4.66        75.52        84.58