[发明专利]抑制人Akt2基因表达的siRNA序列及其融合表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一段能抑制人Akt2基因表达的siRNA序列及其融合表达载体。

背景技术

RNA干扰(RNAi)是多数真核细胞本身固有的一种自我保护现象，既能对抗如病毒基因或人工转基因所表达的mRNA等外源基因的侵害，又能降解自身异常基因产生的mRNA。以基因转录后沉默的方式或诱导DNA甲基化的方式对含有其同源序列的基因表达进行干涉。

近年来，人们利用这一现象针对要研究的基因表达进行阻断，从而产生相应的功能缺失表型，形成RNAi技术。新近的RNAi技术，是利用DNA表达载体直接在体内表达短发夹状RNA(shRNA)，特异性封闭相应的靶基因mRNA，抑制mRNA的翻译。与早期的RNA干扰技术相比，该方法的特异性和干扰效率均有较大提高，已广泛应用于多种研究领域。

蛋白激酶B(Akt)是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，包含Akt1、Akt2、Akt3三种亚型，其中Akt2在多种肿瘤中均有表达。Akt最早发现于引起鼠白血病的逆转录病毒癌基因v-Akt编码的融合蛋白中，至今在哺乳动物体内还没有发现Akt基因的突变体。研究证明，Akt是胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、表皮生长因子受体HER-2/neu、血管内皮生长因子受体(VEGF-R)、血小板源性生长因子受体(PDGF-R)等受体酪氨酸激酶或G.蛋白偶联受体等参与的细胞外信号通路上游的重要会聚点，同时Akt也是磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)信号传导通路的中心环节。其功能除了涉及细胞周期调控，凋亡启动等细胞生存调节外，还参与血管生成、端粒酶活性和细胞侵袭性等诸多重要的生理及病理过程。目前的研究发现，Akt是肿瘤发生的重要信号分子，其亚型Akt2是由481个氨基酸组成的蛋白质，当其第308位的丝氨酸和473位的苏氨酸磷酸化时，激酶活性增高，发挥促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。

发明内容

本发明是为了进一步研究Akt2在肿瘤发生发展中的作用提供一个有效的工具，也为肿瘤的基因治疗提供了一个新的技术手段，而提供一段抑制人Akt2基因表达的siRNA序列及其融合表达载体。

本发明通过基因敲除技术，即siRNA的方法抑制Akt2的表达。利用RNAi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这些基因保持在沉默或休眠状态，从而使肿瘤细胞增殖速度减慢，凋亡加快，显示了RNAi技术用于肿瘤基因治疗的可行性和有效性。RNAi过程中，由双链RNA分子加工而成的19-23个核苷酸的RNAs就称为siRNA，是诱导基因沉默的第一步，它与RNAi特异性酶结合，形成沉默复合物，特异降解与siRNA同源的靶mRNA。

抑制人Akt2基因表达的siRNA序列，该序列与Akt2mRNA互补；具有抑制人Akt2基因表达的功能，其作用位点Akt2mRNA(NM_001626 CDS：263-1708)1570-1588，

其核酸序列如下：5’-TTCATCATCGAAGTACCTT-3’。

一种抑制人Akt2基因表达的siRNA序列的融合表达载体，其融合表达载体由合成的抑制人Akt2基因表达的siRNA序列模板与pRNAT-U6.1/Hygro载体相连接而成，将其转染人乳腺癌细胞后能够特异降解与siRNA同源的Akt2的mRNA，抑制人Akt2基因表达；

其中合成抑制人Akt2基因表达的siRNA序列模板为：两端带有酶切位点，3’端为HindIII，5’端为BamHI，合成抑制人Akt2基因表达的siRNA序列模板的核酸序列如下：

5’GGATCCCAATTCATCATCGAAGTACCTTTTCAAGAGAAAGGTACTTCGATGATGAATTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’。

本发明通过脂质体将融合载体转入MDA-MB-231人乳腺癌细胞系中，以control-siRNA作为对照，通过潮霉素压力筛选得到稳定细胞株，用RT-PCR、Western Blot方法检测细胞的Akt2表达水平。结果表明：表达Akt2-siRNA作用的细胞其Akt2的合成明显降低，与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)。

本发明设计的靶向Akt2的siRNA的序列及融合表达载体能够在人乳腺癌细胞中表达特定的siRNA，并能够有效地抑制Akt2的基因表达，为进一步研究Akt2基因在肿瘤中的生物学功能提供了可行的手段。