本发明公开了一种特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉的甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒。本发明根据GeneBank中公布的Influenza A Viruse(H1N1)virus 2009年北美变异株M基因、HA基因序列和Influenza A Viruse(H3N2)流行株的HA基因序列,通过序列比对寻找高度保守的区域,设计特异性引物和TaqMan探针,研制检测方法中的关键试剂——探针、引物和阳性对照(构建甲型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒基因重组克隆质粒),经各反应条件的优化和特异性、敏感性和重复性试验,建立了甲型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法,一次试验即可同时特异性地检测甲型流感病毒、H1N1亚型流感病毒和H3N2亚型流感病毒。